汉族冠心病与ABCA1基因C69T多态性的相关研究

                作者：王玉明　李亚　郑人源　潘克俭  

【摘要】  　　目的 探讨ATP-Binding Cassette Transporter 1(ABCA1)基因C69T多态与汉族冠心病（CHD）的关系。方法 以264例CHD患者和278名性别、年龄匹配的正常人为对象进行病例-对照研究；采用PCR-RFLP技术对ABCA1基因C69T多态位点进行分析。结果 ABCA1基因C69T多态在CHD组与对照组分布差异无统计学意义（P＞0.05）;CC基因型和T等位基因携带者患者间各项血脂水平及心血管事件发生率比较差异均无统计学意义。结论 ABCA1基因C69T多态性与汉族人群CHD不存在关联。

【关键词】  冠心病；ABCA1基因；动脉粥样硬化；单核苷酸多态性

    Abstract：Objective To investigate the relationship between ATP-Binding Cassette Transporter 1(ABCA1)gene C69T polymorphism and coronary heart disease in the Han people.Methods 264 CHD patients and 278 age，sex-matched control subjects were enrolled in this Case-control study for analysis of C69T polymorphism in ABCA1 gene by PCR-RFLP method.Results The distributions of ABCA1 allelic and genotypic frequencies did not significantly differ between CHD patients and controls;No significant differences of both coronary events and plasma lipid levels were observed between patients with CC genotype and that with T allele.Conclusion The C69T polymorphism in ABCA1 gene is not correlated with CHD in the Han peope.

    Key words:coronary heart disease；ATP-Binding Cassette Transporter 1 gene；atherosclerosis；single nucleotide polymorphism

    收稿日期  ２００６－０３－２４    修回日期  ２００６－０４－０５

    作者简介  王玉明(１９５８－  ），河南郑州人，副教授，医学硕士。

      通讯作者      研究表明，血浆中高密度脂蛋白（HDL）水平与动脉粥样硬化的发生呈负相关〔1〕。ABCA1基因编码一种跨膜蛋白，该蛋白参与调控胆固醇的细胞流出过程，从而在胆固醇逆向转运和HDL生成的起始阶段发挥关键的作用〔2〕。文献报道，ABCA1基因突变导致细胞内胆固醇流出减少，血浆中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）严重缺乏，早发CHD的风险增高〔3、4〕。此外，ABCA1基因的某些单核苷酸多态也可影响血脂水平或个体对CHD的易感性〔5〕。我们对四川汉族健康人群和CHD患者ABCA1基因C69T多态进行了筛查，并探讨了该多态与CHD的关系。

    1  对象和方法

    1.1  对象

    1.1.1  对照组  无血缘关系的四川地区汉族健康个体278名（男165名、女113名），平均年龄(58.9±8.7)岁，经询问病史、体检、心电图等检查排除心血管疾病史。

    1.1.2  冠心病组  冠心病患者264例（男158例、女106例），平均年龄(60.3±8.8)岁。所有病例均经冠状动脉造影证实为CHD，其冠状动脉至少有一支狭窄度≥50%。

    1.2  方法1.2.1  血脂水平的检测  研究对象均采用禁食12h后取外周血5ml测定血脂水平。TG（甘油三酯）和TC（总胆固醇）采用氧化酶法测定，HDL-C、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）用PEG变构酶法测定。

    1.2.2  研究个体DNA的制备  采集病例与对照外周血5ml，ACD抗凝。盐析法抽提DNA。

    1.2.3  ABCA1基因多态片段的PCR扩增  根据基因组序列设计PCR引物，引物序列为：正向：5′—GGCTTTGACCGATAGTAACCT—3′、反向：5′—CTCTTTCTCCTACCCCTTGAC—3′。扩增片段长度为270bp。PCR反应体系：总体积25μl，包括1.5μl基因组DNA，Taq DNA聚合酶1U，MgCl2浓度1.5mmol/L，10×buffer 2.5μl，dNTP各200μmol/L。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。

    1.2.4  PCR产物的酶切消化  取10μl PCR产物，分别加入4U限制性内切酶BsmA1，2μl 10×酶切缓冲液,并加超纯水至总体积20μl，37℃水浴保温16h。酶切产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶分析仪判定基因型。

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    1.2.5  统计学处理  计算各组基因型及等位基因频率，采用χ2检验确认符合遗传平衡；组间分类资料比较用χ2检验；组间定量资料比较用t检验。数据用SPSS12软件分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

　　图1  C69T多态的RFLP-PCR电泳结果1：TT基因型；2、4、6：CC基因型；3、5：CT基因型；M：DNA分子量标准(puc19／MspI)

    Fig.1  Electrophoresis result of PCR-RFLP analysis of C69T polymorphism

    Lane 1:TT homozygote;Lane 2、4、6:CC homozygote;Lane 3、5:CT heterozygote;M:DNA marker(puc 19/MspI)

    2.1  基因型的鉴定

    PCR产物经酶切后，电泳显示3种基因型：CC基因型，无酶切位点，显示270bp一条带；TT基因型，存在酶切位点，显示207bp一条带（酶切产生的63bp小片段未显示）；CT基因型，显示270bp、203bp两条带(图1)。

    2.2  CHD组与对照组间基因型和等位基因频率的比较（表1）

    两种多态基因型在两组人群中分布符合遗传平衡（CHD组：χ2=0.715，P=0.398；对照组：χ2=0.375，P=0.54）。等位基因频率、基因型频率在CHD组和对照组间分布差异无统计学意义（P＞0.05）。 表1  ABCA1基因C69T多态的等位基因频率及基因型频率在对照组

    2.3  CHD组分组后的临床特征比较（表2）将CHD患者按是否有C等位基因分成两个亚表2  不同基因型患者临床特征比较组，比较两个亚组临床指标的差异。t检验结果表明，CC基因型患者与T等位基因携带者患者在血脂水平及心血管事件发生率的差异无统计学意义（P＞0.05）。

    3  讨论

    CHD是一种复杂的多基因病，研究表明多种环境因素和遗传因素与CHD有关，尤其是与脂代谢有关的多个基因在冠心病的发生发展中起重要作用。从分子遗传学的角度研究冠心病病因，可为冠心病的预防和治疗提供新的途径。

    C69T多态为ABCA1基因5′端非翻译区的C→T转换。Zwarts〔6〕等在对荷兰CHD患者的研究中发现，C69T多态与CHD病情程度及动脉粥样硬化进程关联。其中，T等位基因携带者患者突发心肌梗塞、死亡等心血管事件的频率较CC基因型患者显著增高，提示该多态可能通过影响mRNA转录或与ABCA1基因其它功能性多态位点处于连锁不平衡而起作用。本研究分析了四川汉族健康人群和CHD患者C69T多态性。结果显示，C69T多态的频率分布在两组间无差异显著性；同时，CC基因型患者与T等位基因携带者患者在血浆HDL-C等血脂指标以及突发心血管事件频率的差异均无显著性。提示C69T多态与汉族人群CHD不存在关联。

    本研究结果未能证实ABCA1基因C69T多态与CHD相关联，可能的原因是，①该多态存在明显的种族差异，导致与Zwarts等的分析结果不一致。②不同实验设计方案可能导致不同的结论。Zwarts等采用的是基于CHD患者的分析方法，而作者采用的是基于人群的病例-对照法，可能导致关联分析检测灵敏度的降低。③本研究样本量偏少也可能降低关联分析的统计效能。

【参考文献】
  〔1〕Wilson P W F，Abbott R D，Castelli W P．High Density Lipoprotein Cholesterol and Mortality．The Framingham Heart Study〔J〕.Arteriosclerosis，1988，8：737-741.

〔2〕Attie A D，Kastelein J P，Hayden M R．Pivotal Role of ABCA1 in Reverse Cholesterol Transport Influencing HDL Levels and Susceptibility to Atherosclerosis〔J〕．J Lipid Res，2001，42：1 717-1 726.

〔3〕Brooks-Wilson A，Marcil M，Clee S M，et al．Mutations in ABC1 in Tangier Disease and Familial High-Density Lipoprotein Deficiency〔J〕．Nat Genet，1999，22：336-345.

〔4〕Rust S，Rosier M，Funke H，et al．Tangier Disease is Caused by Mutations in the Gene Encoding ATP-Binding Cassette Transporter 1〔J〕．Nat Genet，1999，22：352-355.

〔5〕Singaraja R R，Brunham L R,Visscher H，et al．Efflux and Atherosclerosis,The Clinical and Biochemical Impact of Variations in the ABCA1 Gene〔J〕．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23：1 322-1 332.

〔6〕Zwarts K Y，Clee S M，Zwinderman A H，et al．ABCA1 Regulatory Variants Influence Coronary Artery Disease Independent of Effects on Plasma Lipid Levels〔J〕．Clinical Genetics，2002，61：115-125.

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