作者：夏晓峰 郭峰 钱宝华 花美仙
【摘要】 目的：运用系统血液免疫反应分离实验体系，探讨在抗原激活的情况下异体血细胞对反应体系中细胞因子含 量水平影响的变化规律。方法：以 S180 作为激活抗原，加异体血细胞与自体血细胞对比，37℃孵育 1 h，取上清液用 ELISA 法测定 IL-8、TNF -α、IFN -γ的分泌量。结果：IL-8 的分泌量异体红细胞实验组〔（133.92±135.85）%〕与自体红细胞对照组〔（37.93±27.74）%〕相比明显上升（P < 0.05）；TNF -α的分泌量异体红细胞实验组 〔（8.31±3.57）%〕与自体红细胞实验组〔（16.55±10.38）%〕相比明显下降（P < 0.05）；IFN -γ分泌量无明显差异。结论：异体红细胞对自体血液免疫反应细胞因子的分泌具有双向调控作用，提示异体输血对受者的血液免疫反应具有干扰和失平衡的不良影响。
【关键词】 淋巴细胞；红细胞；抗原；免疫调控；细胞因子
Effects of Autogenetic and Allogenous Blood on Cytokines by Means of Natural Isolated Experimental System
〔Abstract〕 Objective Autogenetic and allogenous erythrocytes regulate the immunological reactions activated by antigens by means of natural isolated experimental system, to observe the changes of cytokines. Methods Using inactivated S180 as activating antigen and autologous plasma as reaction substratum, After incubation an hour in 37℃, supernate fluid is suspended and detected the change of IL-8、TNF -αand IFN -γ by ELISA assay. Results The secretion of IL-8 of allogenous erythrocytes experimental group〔(133.92±135.85)%〕is much higher than that of autogeneic erythrocytes control group〔(37.93±27.74)%〕 (P < 0.05), The level of TNF -α of allogenous erythrocytes experimental group〔(8.31±3.57)%〕is much lower than that of autogeneic erythrocytes experimental group〔(16.55±10.38)%〕(P < 0.05); the expression of IFN -γ
红细胞在天然免疫防御网络中发挥着重要作用，红细胞在补体系统天然免疫反应的参与下有黏附和调理抗原、清除循环免疫复合物、调控淋巴细胞表达免疫分子和细胞因子等作用。有实验证明在库存血中有多达 14 种以上炎性细胞因子，中性粒细胞弹性蛋白酶和 TNF -α浓度的增加在临床的异体输血时都可造成免疫功能的不利影响[1]。结合了补体的病原体可以被红细胞补体受体免疫分子黏附，激发对致病原发生连锁的系统血液天然免疫反应，同时红细胞还可参与相关免疫细胞分泌细胞因子的调节。
本实验研究是运用全血分离实验体系[2]，通过 ELISA 的方法测定上清液中相关细胞因子 IL-8、TNF -α、IFN -γ分泌量在实验体系反应中的变化，探讨其可能存在的临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酸性枸橼酸钠葡萄糖溶液（acid citrate dextrose, ACD）抗凝的健康成人新鲜全血由解放军上海血站提供。
1.1.2 磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution, PBS）和癌细胞悬液（S180）由解放军上海血站血液免疫研究室自行制备。
1.1.3 红细胞裂解液（10×）购于深圳晶美生物公司。
1.1.4 IL-8、TNF -α、IFN -γ酶联免疫反应试剂盒（ELISA 法）购于法国 DIACLONE 公司。
1.2 方法
1.2.1 血浆的分离制备 采集新鲜的健康成人 ACD 抗凝全血 10 mL，室温下 2 000 r/min 离心 5 min，吸取上层血浆至另一试管备用。
1.2.2 红细胞悬液（RBC）的制备 小心吸取沉底红细胞 100 L，加入 2 mL 生理盐水溶液中洗涤，2 000 r/min 离心 5 min，弃上清，全自动血细胞分析仪计数，光学显微镜下观察证实不含白细胞和血小板后，调整红细胞悬液浓度为 1×108/mL。
1.2.3 白细胞悬液（WBC）的制备 取全血细胞悬液 1.6 mL 加 4 mL 蒸馏水在冰水中轻轻混匀作用不超过 1 min，立即加 4 mL 1.8% 氯化钠液混匀， 2 500 r/min 离心 5 min，弃上清，调整白细胞悬液浓度为 1×106/mL。
1.3 分离实验体系的设计和建立
实验共分 6 只试管，以自体或异体血浆作为反应基质，分离实验组以灭活腹水癌细胞 S180 作为激活抗原，其对照组加 NS 作为对照，即（注：* 为加异体血浆组）：①0.1 mL 异体 RBC+0.1 mL S180+0.2 mL 自体 WBC+0.3 mL 异体血浆 *（加异体血浆）。②0.1 mL 异体 RBC+0.1 mL S180+0.2 mL 自体 WBC+0.3 mL 自体血浆（加自体血浆）。③0.1 mL 异体 RBC+0.1 mL NS+0.2 mL自体 WBC+0.3 mL 异体血浆 * （加异体血浆）。④0.1 mL 异体 RBC+0.1 mL NS+0.2 mL 自体 WBC+0.3 mL 自体血浆（加自体血浆）。⑤0.1 mL自体 RBC+0.1 mL S180+0.2 mL 自体 WBC+0.3 mL 自体血浆（加自体血浆）。⑥0.1 mL 自体 RBC+0.1 mL NS+0.2 mL 自体 WBC+0.3 mL 自体血浆（加自体血浆）。
将上述 6 只试管置于 37℃水浴箱中温育 1 h，加盖，中间摇匀 2 次，间隔 20 min；完成后，2 000 r/min 离心 5 min；小心取出上清液约 400 L 装入安瓿管中，编号，置于 -20℃冰箱中冷藏待测。
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1.4 上清液细胞因子 IL-8、TNF -α、IFN -γ的检测
实验前 20 min 从冰箱中取出试剂盒和待测样品，平衡至室温（25℃），96 孔板用包被缓冲液稀释的试剂，每孔加 100 L，4℃过夜，洗板 3 次；加 100 L 待检样品上清液于已包被的反应孔中（同时做空白、阴性及阳性孔对照），37℃孵育 1 h，洗板 3 次；于反应孔中加入新鲜稀释的 streptavidin-HRP 100 L，室温下孵育 20 min，洗板 3 次；于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 100 L，避光反应 20 min 使其显色；于各反应孔中加入 2 mol/L 硫酸 100 L 终止反应；在 ELISA 酶标检测仪上，于 450 nm 处，以空白对照孔调零后测各孔 A 值，绘制标准曲线，并比较各孔实测值。
1.5 统计学处理
数据以 x±s 表示，统计学处理采用 t 检验或方差分析，P < 0.05 为差异显著。
2 结 果
2.1 IL-8、TNF -α、IFN -γ分泌量（pg/mL）的变化
在 S180 激活情况下，异体红细胞能够对自体血液免疫反应的细胞因子发生调控作用。其中，IL-8 的分泌量异体红细胞实验组 *〔（133.92±135.85）%〕与自体红细胞对照组 〔（37.93±27.74）%〕相比表现出明显上升（P < 0.05）；TNF -α的分泌量异体红细胞实验组〔（8.31±3.57）%〕与自体红细胞实验组〔（16.55±10.38）%〕相比表现出明显降低（P < 0.05）； IFN -γ的分泌量，在各组之间相比均无明显差异（P > 0.05），详见表 1。
2.2 分离体系中各组内 IL-8、TNF -α、IFN -γ分泌量的变化间相关性
分离实验体系中，IL-8 与 TNF -α的分泌量相关性在异体红细胞实验组 *（r = 0.70，P < 0.05）、异体红细胞实验组（r = 0.77，P < 0.05）、异体红细胞对照组 *（r = 0.61，P < 0.05）、异体红细胞对照组（r = 0.68，P < 0.05）和自体红细胞对照组（r = 0.58，P < 0.05）内两指标均呈明显正相关；在各组内 IL-8 与 FN -γ以及 TNF -α与 IFN -γ分泌量的相关性不明显（各组内均为 P > 0.05），详见表 2。
3 讨 论
我们发现在体外系统血液天然免疫反应实验中，异体红细胞（供者）在 S180 抗原激活下，对自体（受者）淋巴细胞的免疫活化发挥双向调控作用，与自体红细胞组相比，异体红细胞组 IL-8 的分泌量呈现一定程度的上升，而 TNF -α的分泌量呈现下降，显示受者免疫反应有异常表现，其血液天然免疫功能受到一定程度的抑制与干扰； IFN -γ的分泌量各组间相比表现紊乱，可能与含量较低有关，具体原因有待于进一步探讨。细胞因子在细胞免疫反应中发挥重要的作用，本课题选取细胞因子作为研究对象，观察其动态变化，在一定程度上能够反映输血后受者免疫功能的变化，为临床输血治疗的选择提供实验依据。细胞因子由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激合成、分泌的一类生物活性物质，种类繁多，功能广泛，可具有拮抗或协同作用，不同的刺激信号在细胞内整合的结果决定了细胞的反应形式，细胞因子在免疫的全过程都发挥着重要的角色作用。现已证明红细胞参与多种免疫细胞的功能调节，根据血液免疫反应路线图理论[3]，为了增加实验的敏感度和对比性，我们采用了全血系统血液免疫反应分离实验研究体系，实验的敏感度有所增加，在 1 h 快速系统血液天然免疫反应体系中，IL-8、TNF -α快速发生改变，提示短时间内异体红细胞进入体内对自体的淋巴细胞天然免疫反应产生干扰与失平衡的不良影响。自体红细胞的存在可以对 IL-8 有吸附抑制作用，但异体红细胞做为异抗原对受者的血细胞天然免疫反应有激活作用，所以显示异体红细胞组 IL-8 含量较自体红细胞组增高，但 TNF -α反之，异体红细胞可抑制血细胞天然免疫反应产生 TNF -α，使受者系统血液天然免疫反应产生细胞因子的网络失平衡，因而其值低于自体红细胞组。IL-8 主要来源于巨噬细胞及其基质细胞，在激活的情况下，淋巴细胞、粒细胞也可分泌 IL-8，也可由其他内皮细胞受 TNF 活化后合成，通过这种方式 IL-8 被认为是一种重要的 TNF 诱导的中性粒细胞活化时的继发介质[4]， TNF -α来源广泛，主要来源于巨噬细胞，在体外抗原激活的情况下，T、B 细胞也可分泌 TNF -α，其能以旁分泌的方式作用于 Th 细胞，调节 T 细胞的功能[5]。细胞因子在异体输血引起免疫抑制与干扰的过程中起重要作用，红细胞作为血循环中数量巨大的天然免疫细胞，是机体血液免疫反应系统中不可缺少的重要组成部分。红细胞能够在血浆补体系统和其他天然免疫活性物质的协同下，对外来抗原发生快速免疫反应，可以通过对淋巴细胞增殖分化和多种细胞因子分泌的调控发挥免疫调控作用[6]。因此研究自体和异体输血的主要成分红细胞天然免疫调控能力的变化在临床诊治和判断预后等方面有重要的理论创新和应用价值。
通过以上实验可以得出以下结论：异体红细胞对自体淋巴细胞免疫反应表现出抑制与干扰作用，体现在实验中 IL-8 与 TNF -α分泌量的变化，各种细胞因子之间相互调节，使细胞因子网络稳态失平衡。
【参考文献】
〔1〕Escobar GA, Cheng AM, Moore EE, et al. Stored packed red blood cell transfusion up-regulates inflammatory gene expression in circulating leukocytes〔J〕. Ann Surg, 2007, 246:129-134
〔2〕郭峰. 血液免疫反应路线图〔J〕. 深圳中西医结合杂志, 2005, 15(1):1-4
〔3〕郭峰. 血液免疫反应路线图实验系统酵母多糖激活法〔J〕. 深圳中西医结合杂志, 2005, 15(1):8-10
〔4〕Zompi S, Colucci F. Anatomy of a murder-signal transduction pathways leading to activation of natural killer cells〔J〕. Immunology Letters, 2005, 97(1):31-39
〔5〕孙卫民, 王惠琴. 细胞因子研究方法血〔M〕. 北京:人民卫生出版社, 1999. 466-609
〔6〕郭峰, 花美仙, 张乐之, 等. 抗原激活系统血液免疫反应实验研究〔J〕. 中国免疫学杂志, 2007, 23(8):732-737
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