细胞移植修复脊髓损伤的进展

 

【关键词】  细胞移植修复脊髓损伤的进展

　　脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱损伤的严重并发症，其治疗一直是临床工作中困扰人们的难题。SCI修复面临的主要问题是：(1)脊髓空洞、胶质瘢痕构成阻碍轴突生长的机械屏障；(2)原发和继发的神经元凋亡，使脊髓缺乏自我修复能力；(3)神经营养因子缺乏；(4)损伤局部存在抑制轴突再生的因素如Nogo、髓磷脂相关糖蛋白等〔1〕。近年来，细胞移植在实验性SCI的治疗中显示了良好的效果，给SCI的治疗带来了新的希望。本文对细胞移植治疗SCI的研究进展进行综述。
       
　　细胞移植可以通过改变SCI后的病理过程从而促进脊髓功能恢复，主要包括：(1)移植物可填充损伤部位并形成细胞桥，从而为损伤轴突的再生提供机械或生物通道；(2)分泌生长因子，为轴突或神经元再生提供必要条件；(3)替代或提供新的神经元从而形成新的神经环路。目前细胞移植研究较多的是胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞、脐血干细胞、雪旺细胞及嗅鞘细胞等。
 
　　1  干细胞移植
     
　　干细胞具有自我更新和多向分化的能力，体外培养可以向神经元和神经胶质细胞等多种细胞分化，同时也是SCI基因治疗的理想载体细胞。干细胞不仅可以从胚胎组织获取，而且可以从成年哺乳动物的脑或脊髓等组织中获得，其分离纯化及培养扩增方法已较为成熟。

　　1.1  胚胎干细胞  (embryonic stem cells，ESCs)
       
　　ESCs是从动物早期胚胎内细胞团中分离出来的多能性细胞，它有与早期胚内细胞群相似的生物学特征。1998年，Itskovitz-Eldor等〔2〕首次从人类的囊胚取得了ESCs并建立了人的ESCs系。ESCs经体外培养、诱导分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞前体细胞后植入脱髓鞘病变大鼠模型的体内，结果表明ESCs源性的前体细胞可与宿主神经元建立联系并为再生轴突髓鞘化〔3〕。Howard等〔4〕从基因修饰方面对ESCs进行研究，将编码抗凋亡蛋白的bcl-2基因对ESCs进行修饰，移植入SCI部位，6周后发现移植部位发生明显的异常生长，病理检查发现移植部位发现大量未分化细胞，并向首尾端各移行达1.5 cm，结果表明bcl-2修饰的ESCs可以导致细胞的瘤样生长，同对照组相比有更高的死亡率。目前研究来看，ESCs用于SCI的治疗效果是肯定的，但是也存在许多问题有待解决，比如临床应用存在感染逆转录病毒及其它病原体的危险。尤其ESCs移植所涉及到的伦理方面的问题及来源问题限制了其临床应用〔5〕。

　　1.2  神经干细胞(neural stem cellS，NSCs)
       
　　胚胎组织移植促进脊髓再生的根本原因在于其含有的大量NSCs，目前已经可以分离和体外培养NSCs使之分化为各种神经细胞。NSCs具有增殖、自我更新和多向分化能力。成年哺乳动物的中枢神经系统存在一些休眠的NSCs。SCI后这些NSCs可以复苏、增殖、分化来代替坏死凋亡的神经元。Kulbatski等研究表明〔6〕，NSCs不仅存在于胚胎神经系统，如大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、脑室沿线包括侧脑室、第三脑室和第四脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓、视网膜中，也存在于成年动物脑的某些部位，因此NSCs在哺乳动物胚胎期神经系统中的分布具有较大的普遍性。NSCs与其它干细胞类似，在体内的分化过程均受到局部环境中各种信号分子的作用，在环境信号的作用之外，干细胞本身对不同信号的敏感性及不同信号浓度的反应性不同，且表现出分化的时序性，复杂的内外信号系统共同决定着NSC最终的走向。王岩峰〔7,8〕等通过对海马源性研究表明NSCs移植后可以改变脊髓损伤区的微环境，上调脑源性神经营养因子mRNA，促进生长相关蛋白43mRNA的表达，并认为NSCs移植后可存活并促进髓鞘蛋白前脂蛋白基因的表达，是促进脊髓损伤后髓鞘再生的机制之一。2005年，Nakamura等〔9〕从8-9周胚胎脊髓分离的富含NSCs的组织移植物在体外进行培养扩增并用BrdU标记，移植入成年狨猴SCI部位后发现移植的NSCs存活良好并移行到距损伤中心7 mm处。双重荧光免疫染色结果表明移植后8周，NSCs分化成为神经元和少突胶质细胞。同对照组相比实验组有更多的神经微丝。对实验动物进行功能评价，实验组优于对照组。移植NSCs于损伤脊髓替代或补充损伤的神经元，诱导其向特定细胞类型分化并与宿主神经元形成突触联系，是一种非常具有潜在临床应用价值的方法。

　　1.3  骨髓基质细胞(Bone marrow Stromal cellS，MSCs)
       
　　在骨髓除造血干细胞之外还存在一类具有干细胞特点并可以向多种非造血组织分化的细胞，被称为骨髓基质细胞。MSCs具有治疗SCI潜能，可以进行自体分离培养扩增移植，从而避免了伦理方面的问题和免疫排斥反应。加之取材、培养简单，因而被认为是进行人体基因治疗的理想载体细胞。MSCs可分化为多种非造血组织细胞，而且可以对其利用腺病毒或反转录病毒进行基因修饰〔10〕，培养后重新移植入病人。Dezawa等〔11〕将大鼠和人的MSCs分离培养并定向分化成为神经元和雪旺细胞。将分化来的神经元和雪旺细胞进行移植治疗SCI在动物实验中取得了良好的效果。Bakshi等〔12〕从表达人胎盘碱性磷酸酶的转基因大鼠获取骨髓基质细胞，利用腰穿技术将MSCs移植入SD大鼠的SCI部位，降低了SCI的囊变和再损伤，取得满意的疗效，移植入脊髓半切的大鼠脊髓内的人MSCs无需进行免疫抑制即可存活数月而没有炎症或免疫排斥反应的迹象。这些优点使MSCs成为临床基因治疗SCI的可选择细胞。

　　1.4  脐血干细胞(human umbilical cord blood tells，HUCBs)
       
　　人HUCBs具有多向分化潜能，在体外培养或体内移植后可分化为神经细胞，并可促进神经损伤动物的功能恢复。从遗传学角度来讲HUCBs比MSCs更适合于移植治疗SCI。Kuh等〔13〕将HUCBs移植入大鼠SCI部位，通过免疫荧光染色，BBB功能评分，结果表明HUCBs移植组较对照组有更好的疗效，而HUCBs联合脑源性神经营养因子(Brain-derired neutrophic factor，BDNF)组较其它各组疗效更佳。双重免疫荧光染色证实HUCBs分化为各种神经细胞，并诱导运动功能恢复。Zhao等〔14〕将磁柱分选的脐血CD34+造血干细胞和骨髓MSC直接移植到脊髓半切模型大鼠的损伤区周围，结果发现，虽然两组大鼠的神经功能均有明显改善，但前者较后者在移植后7 d和14 d的功能改善更为明显。这表明，在促进SCI的功能恢复方面，脐血CD34+细胞比骨髓MSC发挥作用的时间窗要早。同时，脐血细胞分化、替代损伤的神经元可能不是损伤修复的唯一机制，还可能通过分泌营养因子和调节自体免疫过程来实现神经保护功能。HUCBS来源丰富，取材方便，无任何生理与伦理问题，且有较强的增殖分化能力；HUCBS的低免疫应答性使得同胞间或非血缘供者移植后的急、慢性移植物抗宿主病的发生率低且程度轻，这些优点将使HUCBs成为SCI临床治疗的一个研究方向。

　　2  雪旺细胞(Schwann cells，SCs)
     
　　SCs是周围神经的主要结构和功能细胞，在神经再生中起着重要作用。SCs在神经损伤后，分裂、增殖形成Bungner带，引导轴突生长，并能合成分泌10余种SCs源性神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、成纤维细胞生长因子等和层粘蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质以及神经细胞粘附分子等细胞粘附分子，起到避免周围神经损伤后引起的神经元逆行性死亡，引导和促进轴突再生以及促进髓鞘形成的作用〔15,16〕。近年来，利用SCs移植促进中枢神经系统轴突再生的研究进展迅速。经培养纯化的SCs，无论在体内或体外均能支持和促进脊髓神经突起的生长。Takami等〔17〕以NYU法制作大鼠SCl模型，分别将嗅鞘细胞、SCs以及二者混合移植入损伤部位，12周后行脊髓病理切片、免疫组化染色，结果发现3组脊髓空洞体积均较空白对照组明显减小，细胞向损伤部位两端扩散。SCs移植组轴突再髓鞘化程度明显高于其他3组；SCs移植组实验动物功能恢复最好。从而认为SCs移植在SCI修复中的作用不可替代。SCs移植入SCI部位促进轴突再生和功能恢复具体机制如下：(1)SCI后，SCs可桥接损伤区，并分裂、增殖形成Bungner’s带，引导轴突生长；(2)形成髓鞘，覆盖再生轴索：(3)减轻空腔形成和星形胶质细胞反应，并可以吞噬局部胶质瘢痕；(4)SCs可分泌神经营养因子，而神经营养因子是对神经细胞的生长发育、分化再生及功能具有调节作用的蛋白。
       
　　目前关于SCs的研究倾向于以下两个方面：基因修饰SCs和自体激活SCs。

　　2.1  基因修饰后的SCs移植治疗SCI
       
　　随着分子生物学的发展，通过转基因技术，可以将表达特定物质的目的基因通过重组腺病毒或逆转录病毒、质粒等转入靶细胞内，并保证其存活、分泌生长因子以及引导轴突生长所需的细胞外基质等。近年来基因治疗已被广泛应用于SCI治疗，它可以提供长期、安全、部位局限的促进脊髓功能恢复、轴突再生的物质；不仅如此，它还可以向中枢神经系统中的特定部位的实质内运送营养因子，从而成为当今SCI治疗中的一大热点。冯世庆〔18〕等将NGF和BDNF基因修饰的SCs应用于SCI的治疗，实验表明转基因SCs可以持续大量分泌神经营养因子，从而让局部释放的神经营养因子不断刺激、引导宿主纤维和移植物的整合与联系，促进SCI的修复。陈礼刚等〔19〕将pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞(SC)脊髓内移植，研究显示PSVPoMoat微基因修饰SC可抑制GFAP的表达，促进SCI后神经元的功能恢复以及神经轴突的再生。基因修饰的SCs具有以下特点：(1)移植后能在中枢神经系统内长期存活；(2)能分泌高水平的神经营养因子；(3)使轴突髓鞘化；(4)能诱导对神经营养因子反应的轴突生长旺盛；(5)可在体内长时间的表达转移基因。SCs不仅本身即可促进中枢神经系统的再生、髓鞘的重建和部分神经功能的恢复，同时又可作为SCI基因治疗的移植载体。

　　2.2  自体激活的SCs治疗SCI
       
　　对自体SCs移植的研究一直进展迅速，为了能够更加迅速有效分离SCs，Vroemen等〔20〕利用磁性—活细胞分类(magnetic-actiVated cell separation，MACS)技术分离表达p75低亲和力神经生长因子(low affinity nerve growthfactor receptor，p75LNGFr)的SCs，为临床解决SCs来源提供迅速有效的方法。国内冯世庆〔21,22〕等将自体激活的SCs植入SCI动物模型，自体激活SCs移植后通过顺行示踪法标记脑部皮质脊髓束；标记移植物和P0免疫组化法观察移植物的存活情况；光镜观察脊髓组织形态学改变；并对大鼠后肢神经功能恢复情况用BBB评分进行评价，综合评价对脊髓组织形态与功能的修复作用。并将此研究成果应用于临床，选择合适的SCI志愿者行自体激活SCs移植I期临床研究。结果表明：(1)采用自体激活SCs移植治疗SCI，其自体激活的SCs可持续大量分泌脊髓再生所必需的神经营养因子，显著促进受损神经元再生，诱导再生轴突通过损伤脊髓和移植物界面；(2)移植的SCs能够填充损伤后的脊髓空洞，诱导轴突再生，连接损伤轴突的远、近端，恢复脊髓的解剖完整性，受损的轴突髓鞘化，恢复脊髓的传导能力；(3)自体激活SCs混悬液中含有的巨噬细胞能够吞噬胶质瘢痕，减少脊髓再生抑制性微环境的产生；(4)自体细胞移植无免疫排斥反应，不涉及伦理问题。
       
　　随着SCs的提取、纯化、培养扩增技术和转基因技术、自体激活技术的成熟，SCs移植治疗SCI成为最有希望应用于临床的方法之一，但SCI后功能的恢复很大程度上依赖于再生的轴突能否顺利穿过胶质瘢痕交界区域，能否建立有效的突触联接。植入的SCs在局部的迁移距离非常有限；而且其植入损伤脊髓后是否能长时间存活，从而最大限度地保证损伤轴突再髓鞘化和脊髓再生也尚未确定〔22,23〕。因此，如何保持SCs移植入SCI部位后的生物活性并增加其迁移范围，使再生轴突突破SCI胶质瘢痕界面，建立由功能的突触联接将是今后研究的方向之一。

　　3  嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)
       
　　嗅粘膜神经元是体内唯一生后形成的神经元，它在成熟的个体内可持续分裂，OECs在成年哺乳动物终生都可以成功地诱导嗅觉轴突再生。OEC是一种特殊的胶质细胞，分布于嗅神经的全长构成嗅神经元赖以生存的外环境。OECs兼具雪旺细胞和星形胶质细胞的特点，但它与二种细胞又不同。原位杂交研究提示OEC不仅可以分泌神经营养因子还能表达层黏蛋白、纤黏连蛋白、胶质源性连接素和神经细胞黏附分子等促进轴突的修复和再生。Lopez-Vales等〔24〕将OECs移植入大鼠T8SCI部位，运动功能得到显著改善，为临床应用OECs治疗SCI提供理论基础。Santos等〔25〕的实验结果显示，SCI后植入OECs，大鼠的运动功能和感觉—运动反射得到恢复，相关的上运动神经元轴突再生长入脊髓横断处的远端组织内，并生长较长距离。然而也有一些作者持不同意见，一些实验研究表明并非OECs直接促进了髓鞘化和轴突再生〔26〕。OECs植入SCI部位后，增强了损伤部位自体雪旺细胞的内在功能，和雪旺细胞一起为轴突再生提供良好的三维立体微环境。

　　[8]电大学习网.免费论文网[EB/OL]. /d/file/p/2024/0424/fontbr />
   
　　Collazos-Castro等〔27〕通过实验表明OECs植入SCI部位后实验动物的运动功能并没有得到改善，反而可以导致轴突的异常生长。作者建议在进行临床之前，应该作进一步研究。
       
　　尽管关于OECs的功能众说纷纭，但是植入OECs是治疗SCI的一种有希望的方法，用OECs治疗人类SCI，可直接从患者的嗅粘膜获得OECs并进行培养，用于治疗SCI，可解决免疫排斥反应问题。目前自体OECs移植治疗SCI已经进入I期临床研究阶段〔28，29〕，但真正应用于临床治疗SCI尚需时日。

　　4  总结与展望
       
　　SCI损伤修复实验研究中细胞移植为提高轴突再生能力、替代细胞成分、阻止脱髓鞘和使髓鞘再生等，从而促进脊髓修复，进而为感觉及运动功能的恢复提供了机会，而且某些方面已取得了可喜成就，有些甚至已经进入了临床试验阶段。然而所有这些对脊髓长距离上行或下行纤维的修复是不够的。目前的脊髓再生研究多关注下行运动纤维的再生及运动功能的改善，而事实上，上行感觉纤维的再生及感觉功能的恢复也不容忽视。各移植细胞在脊髓损伤治疗中的作用机理不同，所以联合移植将是研究的一个方向。
       
　　另外SCl的治疗，轴突的再生是受多方面因素影响的。如何克服这些抑制轴突再生的因素，使再生的轴突穿越胶质瘢痕产生有效的突触联接，恢复损伤后的脊髓功能将是值得我们去深入探索的。目前的研究大多还停留在动物实验阶段，要想应用于临床尚有大量问题需要解决。把脊髓再生修复的研究成果应用于临床SCI治疗的工作刚刚起步，还需要我们去深入探索研究。

【参考文献】
  　　〔1〕 Corti S, Locatelli F, Papadimitriou D, Strazzer S, Comi GP. Somatic stem cell research for neural repair: current evidence and emerging perspectives〔J〕.Ce11 Mol Med,2004,8 (3): 329-337.

　　〔2〕 Lerou PH, Daley GQ. Therapeutic potential of embryonic stem ceils〔J〕.Blood gev,2005,19 (6): 321-331.

　　〔3〕 Faulkner J, Keirstead HS. Human embryonic stem cellderived oligodendrocyte progenitors for the treatment of spinal cord injury〔J〕.Transpl Immunol,2005，15 (2): 131-142.

　　〔4〕 Howard MJ, Liu S, Schottler F, et al. Transplantation of apoptosisresistant embryonic stem cells into the injured rat spinal cord〔J〕.. Somatosens Mot Res,2005,22 (1-2): 37-44.

　　〔5〕 Rodriguez CI, Galan A, Valbuena D, et al. Derivation of clinicalgrade human embryonic stem cells〔J〕. geprod Biomed Online, 2006,12(1): 112-118.

　　〔6〕 I Kulbatski,AJ Mothe, H Nomura, and CH Tarot. Endogenous and exogenous CNSderived stem/progenitor cell approaches for neurotrauma〔J〕. Curr Drug Targets, 2005,6(1): 111-126.

　　〔7〕 王岩峰，吕刚，李花等.神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF与GAP—43基因表达的影响〔J〕.2004，12：1870-1872.

　　〔8〕 王岩峰，吕刚，刁延娜,等.神经干细胞移植对脊髓损伤后PLP基因表达的影响〔J〕.中国矫形外科杂志，2005，13：605-607.

　　〔9〕 Nakamura M, Toyama Y, Okano H,et al. Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury〔J〕.2005,45(ll):874-876.

　　〔10〕Lu P,Jones LL, Tuszynski MH. BDNFexpressing marrow stromal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cord injury〔J〕.Exp Neurol. 2005,191(2):344-360.

　　〔11〕Dezawa M, Hoshino M, Nabeshima Y, et al. Marrow stromal ceils: implicationsin health and disease in the nervous system〔J〕. Curr Mol Med,2005,5(7):723-732.

　　〔12〕Bakshi A, Barshinger AL, Swanger SA, et al. Lumbar puncture delivery of bone marrow stromal cells in spinal cord contusion: a novel method for minimally invasive cell transplantation〔J〕. J Neurotrauma,2006,23(1):55-65.

　　〔13〕Kuh SU,Cho YE, Yoon DH, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brainderived neutrophic factor into the spinal cord injured rat〔J〕. Acta Neurochir (Wien),2005,147(9):985-992.

　　〔14〕Zhao ZM,Li HJ, Liu HY, et al. Intraspinal transplantation of CD34+ human umbilical cord blood cells after spinal cord hemisection injury improves functional recovery in adult rats〔J〕. Cell Transplant. 2004,13(2):113-122.

　　〔15〕Hu Y,Leaver SG, Plant GW, et al. Lentiviralmediated transfer of CNTF to schwanncells within reconstructed peripheral nerve grafts enhances adult retinal ganglion cell survival and axonal regeneration〔J〕. Mol Ther, 2005,11(6):906-915.

　　〔16〕Girard C,Bemelmans AP, Dufour N, et al. Grafts of brainderived neurotrophic factor and neurotrophin 3transduced primate Schwann cells lead to functional recovery of the demyelinated mouse spinal cord〔J〕. J Neurosci, 2005, 25(35): 7924-7933.

　　〔17〕Takami T,Oudega M, Bates ML, et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord〔J〕. Neurosci,2002,1;22(15):6670-6681.

　　〔18〕Feng SQ,Kong XH, Guo SF, et al. Treatment of Spinal Cord Injury with CoGrafts of Genetically Modified Schwann Ceils and Fetal Spinal Cord Cell Suspension in the Rat〔J〕.Neurotoxicity Research, 2005,7(1,2):169-177.

　　〔19〕Chen L,Gao L, Piao Y,et al. pSVPoMcat modifying Schwanncell to protect injured spinal neurons in rats〔J〕. Chin J Traumatol. 2002,5 (5): 316-320.

　　〔20〕Vroemen M,Weidner N. Purification of Schwann cells by selection of p75 low affinity nerve growth factor receptor expressing cells from adult peripheral nerve〔J〕.J Neurosci Methods,2003,15;124(2):135-143.

　　〔21〕冯世庆，郭世绂，王沛，等.自体激活雪旺细胞移植治疗脊髓损伤的基础与临床研究初步报告〔J〕.中华医学会第七届全国骨科学术会议汇编，广州，2004：302.

　　〔22〕冯世庆.雪旺细胞移植治疗脊髓损伤研究进展〔J〕.中国现代神经疾病杂志，2004，24：276-279.

　　〔23〕Oudega M, Moon LD, de Almeida Leme RJ. Schwann cells for spinal cord repair〔J〕. Braz J Med Biol Res, 2005,38(6):825-835.

　　〔24〕LopezVals R, Fores J, Verdu E, Acute and delayed transplantation of olfactory ensheathing cells promote partial recovery after complete transection of the spinal cord〔J〕. Neurobiol Dis,2006,21(1): 57-68.

　　〔25〕SantosBenito FF, RamonCueto A. Olfactory ensheathing gl ia transplantation:a therapy to promote repair in the mammalian central nervous system〔J〕.Anat Rec B New Anat,2003,271(1): 77-85.

　　〔26〕Boyd JG,Doucette R, Kawaja MD. Defining the role of olfactory ensheathing cells in facilitating axon remyelination following damage to the spinal cord〔J〕.FASEB J. 2005,19 (7): 694-703.

　　〔27〕CollazosCastro JE, MunetonGomez VC, NietoSampedro bi. Olfactory glia transplantation into cervical spinal cord contusion injuries〔J〕.J Neurosurg Spine,2005,3(4): 308-317.

　　〔28〕MackaySim A.Olfactory ensheathing cells and spinal cord repair〔J〕.Keio J Med.2005,54(1): 8-14.

　　〔29〕Marshall CT,Lu C, Winstead W, et al. The therapeutic potential of human olfactoryderived stem cells〔J〕.Histol Histopathol,2006,21(6): 633-643.

　　[8]电大学习网.免费论文网[EB/OL]. /d/file/p/2024/0424/fontbr />