两种不同三维结构βTCP材料体内血管化的比较研究

         作者：白峰，王臻，李爱民，卢建悉，王超峰，付索超

【摘要】  〔目的〕研究支架内部三维结构对βTCP材料体内血管化的影响。〔方法〕将2种不同三维结构的βTCP材料(孔径400～500 μm，内连接径为120 μm的圆片状βTCP材料和相同成份、重量的βTCP材料碎颗粒，直径在100～200 μm)包埋入24只成年新西兰兔的双侧腰背筋膜内，术后1、2、4、8周对材料进行组织学观察、同位素骨扫描及扫描电镜等检查，观察2种不同内部三维结构βTCP材料的体内血管化情况。〔结果〕两组材料具有良好的生物相容性。术后1周，2种结构材料只有周边部分孔隙内可见幼稚的毛细血管形成。术后4周，圆片状人工骨材料内全层出现新生血管，血管数量增多，管腔变大，外周血管发育成熟，进入血管化高峰期。术后8周血管数量无明显增多，仅有管腔增大，偶见成熟的微血管结构。而颗粒状材料血管化进程缓慢，血管数较少，管腔小，结构差。4周时，仍以发育幼稚的毛细血管为主，8周时出现部分毛细血管闭塞。〔结论〕材料孔隙间的连通是影响材料体内血管化的关键因素，具体地说，较高的连通率可以使材料血管化更为完全，而连通径的大小可以限制新生血管管腔的大小。

【关键词】  支架； 血管化； 骨组织工程； β磷酸三钙

　　组织工程骨的再血管化是保证其成活并发挥生物学效能的基础和关键，尤其在治疗大段骨缺损中，移植的人工骨材料的血管化进程和有效程度对成骨愈合的优劣起到关键性的作用。对于组织工程骨的血管化研究，大多数实验都以复合细胞和细胞因子及利用外科手术技术来促进移植材料的血管化进程〔1〕。移植材料的内部结构及其良好的组织相容性及生物活性，才是周围移植床的增生血管能顺利长入其中的最主要因素。本研究选用2种不同三维微观结构的βTCP材料，未复合任何细胞及细胞因子，直接植入具有丰富血管网的兔腰背筋膜下〔2〕，比较2种结构的血管化程度的优劣，以寻找更有利于血管化的内部结构。

　　1  资料与方法

　　1.1  材料
       
　　本研究用上海贝奥路生物材料有限公司提供的可控性微结构β磷酸三钙生物陶瓷(βTCP)，它由β磷酸三钙粉末，经大于1 100 ℃高温烧结而成。该陶瓷被制作成厚0.4 cm，直径1.4 cm的圆片体，具有独特的内部微结构，气孔率为75％，球孔径400～500 μm，孔的内连接径为120 μm，孔型为均一的球形，孔壁光滑，孔隙连通率100％，力学强度5～25 MPa，钙磷比为1.50±0.02。同时用相同重量和成份的β磷酸三钙致密微颗粒(直径100～200 μm)作为对照。

　　1.2  动物模型制备与分组
       
　　实验动物为健康新西兰兔24只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不限(由第四军医大学动物实验中心提供)，随机分为两组，一组植入圆片状βTCP材料(wafer tricalcium phosphate，WTCP)，对照组植入相同重量βTCP致密微颗粒材料(granulation tricalcium phosphate，GTCP)。
       
　　以速眠新I号0.2 ml／kg的剂量肌肉注射麻醉，常规消毒铺单后，取背部正中纵行切口，长约5～6 cm，双侧皮下游离，显露腰背筋膜，在肩胛下角内下方距离正中线约2cm处纵向切开腰背筋膜，深至肌层表面，切口长约3 cm，在切口内侧腰背筋膜与肌层之间作钝性分离，以脊柱为中线，左右两侧各做2个袋状结构，按分组将2种结构材料随机埋入左右两侧袋中，缝合腰背筋膜切口，颗粒组筋膜袋内颗粒填塞紧密后做荷包缝合，探查见材料固定确实。仔细止血、清洗伤口后逐层关创，缝合皮肤。术后青霉素40万单位im Bid，庆大霉素4万单位im Bid，预防感染3 d，伤口覆盖无菌敷料，给予正常饲食。术后1、2、4、8周分别取材观察。

　　1.3  观察指标

　　1.3.1  大体观察  观察术后实验兔活动及进食情况，伤口愈合情况，植人材料取出后的大体观察及其与周围组织的关系。

　　1.3.2  组织学检查  1、2、4、8周，分批处死实验动物后取出植入物，以中性甲醛固定2 d后，脱钙、冲洗、脱水、石蜡包埋，垂直方向连续作5张组织切片，切片厚度5 μm，行常规HE染色，观察材料内血管化及组织长入情况。

　　1.3.3  新生血管计数  用LEIICA  MTLA全自动专业研究级显微镜(德国LEIICA公司)进行图像采集。于200倍的光镜下随机采集10个视野，以内皮样细胞形成包含红血球的管腔为新生血管的判定标准，用Image pro plus专业图像分析软件进行新生血管计数，计算血管面积占材料剖面面积的百分比。

　　1.3.4  扫描电镜观察  每个时间点各取部分标本戊二醛固定，慢速喷金后扫描电镜观察材料内部结构及组织与材料面相容性情况。

　　1.3.5  放射性核素骨显像监测  于术后2、4、8周观测不同结构移植材料的成骨活性和血管化程度。经耳缘静脉弹丸式注射99 mTcMDP(18.5 MBq／kg)，置于核素扫描仪上行血液灌注显像，矩阵256×256，能峰140 Kev，4 h后，以1帧／5 min采集1幅静态图像。以双侧背部材料植入区直径1.5 cm大小的圆形为感兴趣区(ROI)，用ROI计数(单位像素)分析不同时间点各种结构材料的延迟相的放射性计数，以反映2种结构材料不同时间点的活化程度。

　　1.4  统计学处理
   
　　所有数据用SPSS 8.0软件处理。数据用±s表示。两组内每组的4个时间点之间差异用完全随机设计的多样本均数比较的方差分析，同一时间点组间的差异用两样本均数t检验，P<0.05为有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  大体观察
   
　　术后所有动物切口均无感染性破溃和分泌物。伤口均为I期愈合。取材时见所有植入物局部无感染、坏死、囊性包裹。8周时，两组材料均有明显降解，其中WTCP材料体积缩小，边缘变钝。

　　2.2  组织学观察
   
　　HE染色结果显示，两组植入物周边组织均无明显炎细胞浸润。术后1周，WTCP材料外周孔隙内可见幼稚的毛细血管形成，部分管腔内有少许红细胞。外周部分孔隙内有稀疏薄层纤维组织。2周时，WTCP材料组纤维组织和和新生血管进一步向内部延伸。纤维组织层变厚，血管管腔增大，数量明显增多，并有血管的充盈。大管腔血管主要集中在外周部分，由外向内，管腔越小，结构越幼稚。内层部分孔隙内只见少量纤维母细胞和幼稚毛细血管，无组织形成(见图1a)。4周时，WTCP材料全层出现新生毛细血管，血管数量进一步增多，管腔变大。纤维组织长入内层，但较外周稀疏。孔隙内细胞数量增多，多以成纤维细胞为主，外周部分孔隙周边可见多核巨噬细胞聚集。8周时，WTCP材料面积有所缩小，纤维组织含量增多，血管数量恒定，材料内层出现较大管腔毛细血管，部分孔隙内可见成熟的微血管结构。而GTCP组血管形成缓慢。2周时血管数量较WTCP组少，主要以幼稚毛细血管为主，管腔内少有红细胞(见图1b)。4周时GTCP材料面积缩小，纤维组织致密并相互连接成片，将材料分割成大小不一的“岛状”，多核巨噬细胞数量较WTCP材料多，且中心区也有出现。血管数量增多，但血管形成结构差，偶见富含红细胞的较大管腔毛细血管。至8周时，开始有部分充盈样毛细血管结构出现，但血管数量较4周时减少。多核巨噬细胞分布较广泛，且细胞体积较大。(血管的统计结果见表1)

　　表1  各时间点两种结构血管面积比与血管数量（略）

　　注：1周时两组材料血管化程度无明显差异(P>0.05)，2、4、8周两组新生血管数和血管面积比均有显著差异(P<0.05)，随着时间延长，血管数量和血管面积比呈上升趋势(P<0.05)。

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　　2.3  扫描电镜观察
   
　　2周时，WTCP材料孔隙结构完整，大小均匀，无破坏，有纤维组织和血管从孔隙内长入，并穿过规则的孔内连通道进入相邻孔隙，形成串珠样结构。孔内组织与孔壁有一定的间隙，GTCP颗粒间所形成的自然孔隙大小不一，连通不规则，部分间隙通道狭小，个别颗粒接触致密，致一些相邻孔隙出现连接盲区。孔隙内可见有纤维组织填充，表面散在红细胞。4周时，两组材料表面与组织连接紧密。WTCP材料表面可见丰富的毛细血管网，血管通过浅层孔隙向内部延伸，组织的生长延伸方向与孔隙连接的轴线平行。孔径和孔内连接径有所增大，孔壁欠光滑，表面出现直径在2～4 μm之间的微孔。GTCP纤维组织相互连接，将材料分割成“小岛状”，生长形式不规则，颗粒体积缩小。8周时WTCP材料外周结构发生崩解，孔隙结构破坏，纤维结缔组织连接，将崩解材料分割成岛状。结构与GTCP相似，并可见崩解形成的不规则微颗粒。内层仍可见较完整的球形孔隙结构。而GTCP组材料区面积缩小，已被大片的纤维组织所替代。(见图2a、b)

　　2.4  放射性核素骨显像观察
   
　　静脉注射99mTcMDP后，可观察到实验兔背部两侧植入区有放射浓集影。4周放射浓集影较2周明显，8周较4周相比差异不明显。与WTCP组相比GTCP组显现较淡的放射浓集影(见图3a、b)。2组不同时间ROI放射性计数见表2。

　　表2  不同时间2组ROI放射性计数（略）

　　3  讨论
       
　　组织工程化人工骨修复骨缺损的基础是它的血管化。体外构建的组织工程骨，植入体内后同样必须迅速建立充分的血供，为种子细胞功能活动提供充足的营养，只有这样才能保证组织工程骨的成活及骨缺损的修复，这在完成较大骨缺损修复时显得尤为重要。
       
　　有研究表明，在富含有细胞及骨诱导因子的自体松质骨，其移植后对成骨和愈合发生关键影响的仍是其作为疏松多孔体能够快速发生血管化这一因素。作为组织工程化人工骨支架的骨替代材料，具备这种类似的多孔框架结构而发生快速血管化，建立与宿主机体一体化的骨修复、再生机制，可能将成为决定移植后效应的最重要因素〔3〕。
       
　　随着材料制作技术的发展，目前可以制作出具有不同孔径，不同孔隙连通率的类似天然骨组织的三维孔腔结构的人工骨。而选择一种更有利于人工骨体内血管化的三维微观结构是本研究的重点。另外，通过动物解剖发现成年新西兰兔的腰背筋膜中血管网非常丰富，是人工骨着床的理想场所，因此本研究将材料埋入兔的腰背筋膜袋中。为了单纯研究结构对材料血管化的影响，植入前材料未复合任何细胞和细胞因子。
       
　　本实验发现，2组材料的血管化程度和方式有明显不同，且有一定规律。术后1周，两组材料外周已有少量幼稚毛细血管出现，随着时间的延长，材料外周新生血管密集开始向内部延伸。WTCP组材料4周时，血管化完全，并达到高峰期。而GTCP组血管形成缓慢，血管形成结构差，数量较WTCP组少(P<0.05)，主要以管腔小的纤细毛细血管为主。综合4个时间段的观察，新生血管主要为只有一层内皮细胞的毛细血管，极少见有完整平滑肌层的微血管，孔隙之间的连接处为细胞、血管生长穿行的主要通道，其中可见大量的成纤维细胞和毛细血管。大管腔血管主要集中在外周部分，由外向内，管腔越小，结构越幼稚。放射性同位素骨扫描能够较好的监测人工骨植入体内的活化即血管化程度和骨代谢情况，对两组材料进行不同时间段ECT监测发现，WTCP组背部植入区的放射性计数均高于GTCP组，说明WTCP材料的活化程度要好于GTCP，这一结果与组织学的观察结果相符。
       
　　对于2组材料体内血管化出现的差异，主要是材料内部结构的差异造成的，WTCP良好规则的孔隙结构和较大的孔隙连通径和连通率更有利于血管的形成。另外，通过扫描电镜观察材料内部结构发现，GTCP颗粒相互接触，颗粒之间存在很多不规则的自然孔隙，但部分孔隙连通通道狭小，走行不规则，一些相邻孔隙因颗粒接触致密，出现连接盲区。这些狭小的间隙不利于血管的长入，尤其是大血管的形成。而出现的连接盲区也无法使毛细血管贯穿几个孔隙，并连接成网。而WTCP材料具有规则且较大直径的孔隙间连通道，可以允许较大管腔的新生血管贯穿于较多孔隙之间。血管化后期，这些毛细血管可以交联成网，更好的为组织提供营养。由这一发现可以得出材料孔隙间的连通是影响材料体内血管化的关键因素，具体地说，较高的连通率可以使材料血管化更为完全，而连通径的大小可以限制新生血管管腔的大小。卢建悉等〔4〕在对具有微孔支架结构的可降解生物材料体内、外成骨性能的研究后认为，材料内部孔隙的连通率大小对骨再生的影响更为重要。
       
　　尽管GTCP材料的血管化程度较WTCP材料差，但早期却表现出良好的组织生长状态，因而推测其原因为：（1）只有存活的细胞周围200 μm内若无供应氧和营养的血管存在，细胞才会出现代谢障碍，无法正常行使功能〔5〕。而该组材料所形成的血管数量和密度达到了细胞和组织生长所需，加之这种材料结构有利于周围组织液的渗入，因此早期并不影响细胞增殖和组织生长；(2)GTCP材料作为支架能够为侵入组织提供较大的接触面，尤其是在材料外带。同时组织学观察发现该组材料内含有较多多核巨噬细胞，多核巨噬细胞具有吸收降解βTCP颗粒的能力〔6〕，而颗粒结构更有利于材料的降解和吸收〔7〕。随着材料的吸收降解，将为组织长入提供更多的空间。
       
　　
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综上所述，选择一种有利于骨支架材料血管化的内部三维结构将会加速骨再生的进程。通过本研究，对比不同内部三维结构的生物陶瓷材料的血管化能力，得出了制约材料血管化的结构因素，为优化骨生物材料的内部结构提供了一定的理论基础。但是，骨支架材料内部的三维结构对骨再生的影响还表现在细胞增殖、组织长入、成骨方式及材料降解等方面，有利于材料血管化的支架结构是否同样有利于骨再生过程的其它方面，这是今后研究的方向。
   

【参考文献】
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