TGFβ3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软

            作者：郑东，杨述华，袁晓梅，李进，冯勇，徐亮，梅荣成

【摘要】  目的〕构建生长转化因子(TGFβ3)含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2EGFPTGFβ3，然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(Marrow stromal cells,MSCs)并促进MSCs向软骨方向分化。〔方法〕用RTPCR法从大鼠的胚胎组织中提取TGFβ3的DNA全长，首先连接到pMDl8T载体，扩增、纯化后经测序公司测序确定插入目的基因序列的正确性，然后再用带有EcoRI、PstI内切酶的引物，从pMD18T将TGFβ3的全长再次扩增出来，最后将带有酶切位点的TGFβ3的全长插入到真核质粒pIRES2EGFP中，构建真核表达载体pIRES2EGFPTGFβ3。体外培养大鼠MSCs，应用阳性脂质体将pIRES2EGFPTGFβ3转染到MSCs中，24 h后在荧光显微镜下观察蛋白的表达，流式检测MSCs的转染效率；Westen Blot检测TGFβ3蛋白的表达；之后进行MSCs细胞球团培养，分别于第7、14、21、28 d检测软骨基质胶原Ⅱ，胶原X和Aggrecan的表达，同时用甲苯胺蓝检测蛋白聚糖(proteoglycan)的表达。〔结果〕测序结果和酶切鉴定结果表明成功的构建了pIRES2EGFPTGFβ3质粒，转染MSCs之后，转染的效率达30％。Westen Blot结果表明TGFβ3获得了成功的表达，在接下来的细胞球团培养过程中，转染后MSCs被成功诱导向软骨分化。

【关键词】  转化生长因子β3克隆; 软骨分化; 软骨组织工程; 软骨修复; 真核细胞; 骨髓基质干细胞

　　生长转化因子TGF(transforming growth factor)在软骨的发育和分化中具有重要的作用，在TGF家族中，TGF-β3在间充质细胞系(mesochymal cells MCs)中表达最为明显，并且在MCs的分化和发育过程中具有广泛的生物学效应，其中在促进骨髓基质干细胞(marrow stromal cells,MSCs),向软骨细胞分化的过程中的作用尤为明显〔1〕。研究表明，TGFβ3在MSCs向软骨分化过程中细胞的聚集、增殖和分化的阶段都发挥了重要的调节作用，且通过体外培养的MSCs中加入TGFβ3，已成功和高效的诱导了MSCs向软骨细胞分化〔2〕，因此学者们将TGFβ3等生长因子的应用视为治疗关节损伤和修复软骨损伤的一个新的重要方向。但单纯加入外源性TGFβ3很难研究TGFβ3在体内诱导MSCs向软骨分化的过程，因而无法进行治疗性的研究。单纯在体内直接注射TGFβ3促进MSCs向软骨分化和修复软骨的实验国外有人做过，但副作用大，疗效不能持久〔3〕。将TGFβ3转染到MSCs，通过旁分泌和自分泌的方式起作用就能避免TGFβ3的副作用持久发挥疗效。本实验在构建pIRES2EGFPTGFβ3真核表达载体的基础上，进行了体外转染和诱导MSCs向软骨细胞分化的实验研究，并为进一步的体内实验和构建用于基因治疗的载体如腺病毒载体等提供了基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
   
　　质粒pIRES2EGFP，细菌DH5α(本实验室保存)；PCR Marker、限制性内切酶EcoRI、Pst I、pMD18T Simple Vector、凝胶回收试剂盒购自TakaRa公司；T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶为MBI公司的产品；Trizol试剂盒、质脂体Lipofectamine TM2000转染试剂盒(Invetrogen公司)；小量质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程公司)；DMEM、胎牛血清、胰酶、Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶为GBICO公司产品；其它试剂分别为国产和进口分析纯。

　　1.2  方法

　　1.2.1  扩增TGFβ3基因全长  取1周龄SD大鼠(同济医学院动物房提供)胚胎的中胚层组织(胎鼠的胚芽组织)，匀浆后用Trizol试剂盒提取总RNA，提取2 μg的总RNA通过逆转录试剂盒转录成cDNA，行PCR扩增TGFβ3的编码序列(全长)，上游引物：5’GCCACCATGAAGATGCACTTACAAAGG 3’下游引物5’GCCTCAGCTGCACTTACACGACTTC 3’，长度1242bp。反应条件：94℃变性3 min，然后94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 2 min循环30次，然后72℃延伸10 min，产物行琼脂糖(1％)凝胶电泳，切取大小约为1242bp的条带，用凝胶回收试剂盒回收并纯化。

　　1.2.2  T载体连接  按载体说明书给出的体系进行TGFβ3扩增产物和pMDl8T Simple Vector的连接。连接产物加入至100 μl的感受态细菌DH5α中，冰上放置30 min。42℃加热90 s后，冰上1 min。再加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60 min，8 000 r/min离心5 min，弃上清900 μl，将菌液混匀，取100 μl涂板在含有XGal、IPTG、Amp的L琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选白色菌落，使用菌落PCR法确认载体中插入片断长度的大小。

　　1.2.3  目的基因(TGFβ3)的序列测定和引入酶切位点  提取和纯化质粒pMDl8TTGFβ3，调节核酸浓度0.2 g/L，由上海英骏生物技术有限公司完成测序，测序结果根据Genebank中的TGFβ3完整序列进行同源性比对。接着以质粒pMDl8TTGFβ3为模板再次进行PCR特异性扩增，并在引物中引入内切酶的位点，扩增出基因的全长，上游引物：5’GC GAATTC GCCACCATGAAGATGCAC 3’，下游引物：5’GTCTGCAGAGCTGCACTTACACGACTT 3’，下划线部分分别为EcoR I和Pst I的酶切位点。扩增产物大小为1249bp。反应条件：94 ℃变性3 min，然后94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min循环30次，然后72℃延伸10 min。扩增后产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切取大小约为1249bp的DNA片断回收、纯化。

　　1.2.4  构建重组质粒pIRES2EGFPTGFβ3  TGFβ3扩增产物和质粒pIRES2EGFP分别用EcoR I、Pst I进行双酶切，反应体系参照说明书。之后琼脂糖回收(20 μl)，T4连接酶16℃过夜定向连接。连接产物转化DH5α感受态菌。挑取阳性菌落，扩增后提取和纯化质粒进行酶切鉴定，用EcoR I、Pst I双酶切，1％含琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

　　1.2.5  MSCs的分离培养及纯化  取1月龄的SD大鼠，在无菌的条件下取出大鼠的股骨和肱骨，用完全培养基(20％FBS，DMEM低糖，VitC 50  μg／ml，青霉素100 u／ml，链霉素100 μg／ml两性霉素R 0.25 μg／ml)冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液充分打匀，调整细胞浓度为1×104后接种到培养瓶中。接种后48 h第1次换液，观察细胞的贴壁情况，之后每3 d换１次液，细胞融合约60％～70％时传代，倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况，待细胞传至第3代(3 passage，P3)时，按表面标记(CD34、CD45和STRO1、CD105)通过流式细胞仪进行MSCs纯度的鉴定。

　　1.2.6  测定P3 MSCs的生长曲线  取P3 MSCs消化后稀释成1×103个细胞，接种到96孔板中。分别于第1～8 d，用MMT做细胞活性的检测，绘制生长曲线图。

　　1.2.7  重组质粒pIRES2EGFPTGFβ3转染MSCs  取P3的细胞以每孔1×105接种于24孔板。37℃、5％CO2下培养24 h贴壁后换液。根据P3 MSCs测定的生长曲线，待细胞进入对数生长期的时候，第3 d，常规阳离子质脂体Lipofectamine TM2000转染。转染方法依照产品说明书，转染培养液为无血清培养基。实验组用重组质粒pIRES2EGFPTGFβ3转染MSCs；阴性对照组用pIRES2EGFP转染相同的MSCs；空白转染组不加任何质粒。12 h后，用含5％FBS的DMEM培养基培养至生长稳定，24 h后荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达，流式细胞仪检测细胞的转染效率。

　　1.2.8  Westen Blot检测TGFβ3的表达  转染48 h后换液，收集实验组、阴性对照组的上清液，通过透析袋+PEG浓缩后，Westen Blot检测TGFβ3蛋白含量。

　　1.2.9  MSCs转染后的细胞球团化培养〔４〕  将实验组和阴性对照组转染后的MSCs，消化后分别接种到培养瓶中继续培养。待细胞长满瓶底约70％时，胰酶消化，取2×105个细胞，各自转入到EP管中，1 000 r／min，离心10 min。用微量加样枪小心将细胞沉淀整块的吹下，分别接种到小培养皿中，37℃、5％CO2、饱和湿度下用完全培养基进行培养，24 h待细胞团块贴壁后，换用部分诱导培养基(FBS 5％，DMEM高糖，107 μmol/L地塞米松，50 μg／ml vitC)继续培养。每组(实验组和阴性对照组)分别进行10个球团培养。

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　　1.2.10  MSCs向软骨分化过程中胶原和蛋白聚糖(proteoglycan)表达的检测  上述细胞球团化培养7、14、21、28 d时，分别将培养皿中的细胞团块取出，一部分细胞团块3 mg／ml胶原酶，1 mg／ml的透明质酸酶和0.25％胰酶在37℃消化3 h后，提取总RNA，用RTPCR测定胶原2(COL Ⅱ)、胶原X(COL X)和Aggrecan(Agc)的表达，引物，COL Ⅱ上游：5’GGCGAGTCTTGCGTCTACC3’，下游：5 ’AGGCGTGAGGTCTTCTGTGA 3’(421bp)；COL X上游5’CTAAAGGAGTGCCTGGAC 3’下游：5’TCTTGGGTCATAGTGCTG  3’(479bp)；βactin  上游：5’GTAAAGACCTCTATGCCAACA 3’下游：5’TAGAAGCATTTGCGGTGC 3’(259bp)；Agc上游：5’GAATCCGAGACACCAACG3’下游：5’TCCTCTTCACCACCCACT 3’(406bp)。条件βactin、Agc：94℃预变性5 min，94℃45 s，55℃45 s，72℃45 s，33个循环；COL Ⅱ：94℃预变性5min，94℃45 s，57℃45 s，72℃45 s，33个循环；COL X：94 ℃预变性5 min，94℃ 45 s，50℃45 s，72℃45 s，33个循环。另一部分细胞团块(14、28 d)取出后，4％甲醛固定6 h后，石蜡包埋，用甲苯胺蓝测定基质中的蛋白聚糖(proteoglycan)的表达。

　　2  结果

　　2.1  TGFβ3的质粒的构建过程如图1，目的基因的测序结果：从45bp到1 283bp，通过同源性比对，碱基序列基本一致。其间有两个碱基出现变异(832bp处，C→T和889bp处，G→C)，但在非功能区，也没导致阅读框的移位。酶切鉴定结果如图(2)，各片断大小完全符合设计要求。

　　2.2  原代培养的MSCs呈短梭形，第3d开始出现细胞的增殖现象，第5 d细胞开始出现克隆样生长，集落周围的细胞呈旋涡状排列，经过3次传代，原代MSCs得到了较好的纯化，经过流式细胞仪的鉴定，CD34、CD45和STRO1+、CD105+分别达到了92.36%、90.24%，纯度满足了实验的要求。

　　图1  pIRES2EGFPTGFβ3的构建示意图 （略）

　　图2  pIRES2EGFPTGFβ3的酶切鉴定图。（略）

　　其中：(1)DNA mark；(2)pIRES2EGFPTGFβ3用EcoR I、Pst I双酶切后电泳结果(分别为1 249bp和5 299bp);(3)pIRES2EGFPTGFβ3质粒(6478bp);(4)pIRES2EGFPTGFβ3用EcoR I单酶切结果(6478bp)

　　2.3  P3代的MSCs的MTT检测结果绘制成生长曲线。在第3 d时细胞进入生长旺盛期。

　　2.4  MSCs转染24 h后，荧光显微镜下在实验组和阴性对照组中都可见细胞内荧光蛋白的表达，空白对照组中未见绿色荧光蛋白的表达〔3〕（图3）。通过流式细胞仪进行计数，测定转染的效率为38.26％，证明获得了有效的转染。

　　2.5  Westen Blot检测的检测结果如图4  相对于阴性对照组，实验组MSCs转染后细胞培养基上清液中的TGFβ3蛋白含量明显增高，阴性对照组中也有微量TGFβ3表达，考虑可能为血清中残留和MSCs自发微量分泌。

　　2.6  MSCs球团培养过程中，7、14、21、28 d时，实验组中COL Ⅱ、X和Agc的表达随着时间明显增高，与之相比，阴性对照组的细胞在培养的过程中COL Ⅱ、X和Agc表达量和增加量要显著小于实验组如图5。甲苯胺蓝结果显示在proteoglycan的积累上，阴性对照组也明显小于实验组。

　　图3  质粒转染后，实验组和阴性对照组中绿色荧光蛋白的表达（略） 

　　图4  实验组和阴性对照组上清液中TGFβ3蛋白Westen Blot的检测结果（略）

　　图5  在MSCs的球团培养过程中：实验组和阴性对照组COL Ⅱ、COL Ⅹ、Agc在7、14、21、28 d时的表达（略）

　　3  讨论
       
　　随着生活节奏的不断加快和人口老龄化，由软骨损伤和退变所导致的关节疾病也在不断的增加，这些疾病常常会严重影响患者的生活质量。成熟的软骨组织自我修复能力很差，在损伤后和退变的过程中往往不能得到很好的修复而最终导致疾病的发生。经多年研究，至今仍未能取得实质性的进展。近几年来组织工程技术的发展为彻底解决这类问题带来了希望。通过组织工程技术，可以制备工程化的软骨，替代病变的组织，达到完全修复的目的〔5，6〕。而这种组织工程技术的成功实施，取决于两个部分：(1)合适的工程支架〔7〕，国内外的研究都提供了可行的方案；(2)合适的种子细胞。MSCs由于其独特的特性，例如，有很强的多向分化潜能，能比较容易的获取和扩增，也不存在伦理学的问题，故被认为是一种理想的软骨组织工程的种子细胞〔8〕，但研究表明这种成体干细胞需要在一定细胞因子刺激下才能有效的向软骨细胞分化，研究资料表明，这些能促进MSCs向软骨细胞分化的细胞因子已经得到了很好的证明〔9〕。
       
　　TGFβ3被认为是促进MSCs向软骨分化的一种关键细胞因子，它参与了MSCs向软骨分化过程中的细胞聚集、增殖、分化过程，是触发MSCs向软骨分化的起始因子。已被许多学者用于促进MSCs向软骨分化来修复软骨组织。但是在单纯的使用外源性的TGFβ3的过程中，发现难以避免以下缺陷：（1）单纯的外源性的TGFβ3在体内很容易被降解，不能持续促进MSCs向软骨细胞分化；（2）TGFβ3一般是通过自分泌和旁分泌的途径起作用。因为TGFβ3还有着其它广泛的生物学效应，在体内使用大量外源性的TGFβ3会产生不可避免的严重副作用，例如Grimaud在关节腔内直接注射TGFβ3，虽能促进软骨的分化，但也造成了滑膜和周围肌肉明显的水肿、增殖和代谢的紊乱，最终导致软骨修复的失败〔3〕。
   
　　本实验通过构建TGFβ3的真核表达载体pIRES2EGFPTGFβ3，并转染MSCs，希望将这种转染后的MSCs作为种子细胞，用于软骨的组织工程和软骨的修复。PIRES2EGFPTGFβ3除了目的基因之外还载有加强型绿色荧光蛋白，这2种蛋白既能同时表达，但又不形成融合蛋白，因而这种载体既能对目的基因的表达起到标记作用，又不影响蛋白的功能。pIRES2EGFPTGFβ3转染MSCs后，TGFβ3通过自分泌和旁分泌方式促使MSCs向软骨细胞的分化，这种诱导方式将更加持久、有效和安全。在本实验中，转染pIRES2EGFPTGFβ3后的MSCs在球团培养的过程中被成功的诱导向软骨分化，实验组中细胞COL Ⅱ、X和Agc的表达量都明显高于阴性对照组，而且细胞之间蛋白聚糖(proteoglycan)的积累也明显高于对照组。因此，pIRES2EGFPTGFβ3真核载体的转染成功促进了MSCs向软骨方向的分化，这也为软骨的组织工程提供了更有效的种子细胞，同时也为进一步构建病毒载体和体内基因治疗提供了基础。

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