第1章 云南省三个边境县地区的野外按蚊采集
1.1 实验材料
1.1.1 主要使用的仪器、软件和耗材
主要使用的仪器、软件和耗材 1.1.2 选择野外按蚊采集点
综合云南省与大湄公河次流域国家的接壤状况和云南省本土按蚊的地理分布与种群数量，选定了德宏傣族景颇族自治州盈江县、西双版纳傣族自治州勐腊县和红河哈尼族彝族自治州金平苗族瑶族傣族自治县这三个边境县作为本研究野外按蚊的县级捕蚊区域（图1.1），然后根据县城周边和远离县城村寨的居民点是否养殖牛、猪等大型牲畜、农业种植类型和村寨周边是否有稻田、水塘、沟渠、小溪等适宜按蚊孳生和活动的生态环境等因素确定具体的采样点。最终经过实地调查，在三个边境县选定了7个乡镇的11个村寨作为野外按蚊的采样点（图1.1）。
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1.2 实验方法
1.2.1 采样点信息采集
采用手持移动通信终端（华为）采集 11 个村寨牛圈或人房采样点的经纬度和海拔信息。现场走访，收集并记录采样点周边的农业种植类型和农业、牲圈杀虫剂使用状况[53]。
1.2.2 野外按蚊的捕抓
云南省蚊类分布高峰的 7 月~8 月（图 1.2），在采样点的牛圈或人房采用吸蚊管人工法或紫外灯光诱法捕抓蚊虫。每日的 20 时至 23 时在采样点的牛圈、猪圈中用口吸式吸蚊管捕抓停息在牛圈、猪圈棚顶、四壁低矮且避风处的蚊虫，根据蚊虫停息时身体与停息面成一定角度倾斜的特点，优先捕抓可肉眼判断为按蚊属的雌性蚊虫。将定性滤纸裁剪成长方形，卷成圆柱形内衬在口吸式吸蚊管内，防止在吸捕蚊虫时因人体呼出的水汽在管壁结成水珠，对蚊虫造成黏附而影响蚊虫的存活。少抓多放，及时将吸进吸蚊管中的蚊虫转移到更大空间的蚊笼中暂养，避免过多的蚊虫拥挤在狭窄的吸蚊管空间内，造成蚊虫的翅膀、足等器官受损，影响后续的形态学鉴定准确性。捕抓结束后，立即将蚊笼带回现场实验室（当地疾病预防控制中心的专业实验室或乡镇卫生院的检验科）隔水放置，等待次日进行蚊种鉴定和后续研究。蚊笼外部覆盖不滴水的湿毛巾，用以保持蚊笼内部空气湿润。
当采样点不满足人工捕蚊要求时，使用美国 CDC 紫外诱蚊灯（12V，50Hz，24W）在采样点的人房通宵挂灯诱捕蚊虫（20 时至次日 8 时）。次日及时到采样点人房收取诱蚊灯，将蚊虫收集袋及时带回专业实验室，等待蚊种鉴定和后续研究。
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第2章 云南省边境地区野外按蚊中肠可培养共生菌多样性 研究
2.1 实验材料
2.1.1 供试按蚊
疟原虫的发育和传播严格依赖媒介按蚊进行，而我们的现场工作中仅捕获了4种媒介按蚊，分别是中华按蚊、微小按蚊、昆明按蚊和伪威氏按蚊。尽管如此，我们仍然关注非媒介按蚊的中肠共生菌群，尽管它们没有经受疟原虫的选择压力，但是它们和媒介按蚊生存在相同的栖息地环境，经受相似的环境选择压力。
本章所用的中华按蚊等13种已鉴定蚊虫种类的野外雌性成年按蚊由第一章野外捕蚊所得，经蚊种鉴定后于生理盐水中浸泡备用。
2.1.2 主要使用试剂与仪器
2.1.2.1 主要使用仪器
主要使用仪器 ..................................
2.2 实验方法
将野外采集得到的雌性成年按蚊进行解剖（无菌操作），研磨中肠制备中肠悬液，将中肠悬液涂布到 L-B 平板上培养，然后测序 16S rDNA 基因，比对序列得到可培养共生菌的菌种信息。
2.2.1 按蚊的解剖
尽量在新鲜的状态下解剖按蚊，不选用浸泡于生理盐水中过久的蚊虫。蚊虫的解剖步骤如下：
（1）把第一章中分种类收集好的雌性成年按蚊从无菌的生理盐水中取出，蚊虫依次放入75%乙醇、75%乙醇、无菌生理盐水、无菌生理盐水中，清除体表菌。每个步骤完全浸没蚊虫，时长10~15秒
（2）解剖过程注意无菌操作。把蚊虫放在无菌的载玻片上，滴加一滴无菌的生理盐水，通过体视显微镜用尖头镊子或解剖针分别夹住蚊虫的胸部和第VII腹节，夹着的第VII腹节轻缓地向后拉扯，将前肠以下的组织从蚊虫后部完整拉出。
（3）用尖头镊子或解剖针在马氏管着生处划动，切去后肠和马氏管，同时将前肠从中后部切断，得到完整的中肠。
（4）把取出的中肠转移到含有300μL无菌生理盐水的1.5mL灭菌EP管中备用，一个EP管中只放一只蚊虫的中肠。
2.2.2 中肠可培养共生菌群培养
（1）中肠悬液的制备 使用无菌的研磨棒，充分研磨中肠组织，直至几乎看不到组织碎片，制备得到中肠悬液的原液，然后进行梯度浓度稀释和涂板培养。吹打混匀后，吸取30μL原液加至含有270μL无菌生理盐水的1.5mL灭菌EP管中稀释10倍。如果按蚊为饱血状态，则梯度稀释到10-2浓度。
（2）中肠可培养共生菌培养 将制备得到的全部中肠悬液各吸取100μL悬液，均匀涂布于L-B琼脂平板上，涂布好的L-B琼脂平板放入28℃的恒温培养箱内倒置培养48小时。每个浓度的中肠悬液只涂布一块L-B平板进行培养。培养24小时后，检查平板的长菌情况，如果菌落有长满平板的趋势，则取出放4℃冰箱保存备用。 以上步骤均在现场实验室的生物安全柜或垂直净化工作台中无菌操作完成。
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第 3 章 云南省边境地区野外按蚊中肠共生菌多样性比较研究 ............................... 46
引言 .............................................. 46
3.1 实验材料 ....................................... 46
第 4 章 全文总结与展望 .................................... 73
第3章 云南省边境地区野外按蚊中肠共生菌多样性比较研究
3.1 实验材料
3.1.1 供试按蚊
本章所用的中华按蚊等8种野外雌性成年按蚊已由第一章鉴定明确按蚊的种类。
3.1.2 主要使用试剂与仪器
3.1.2.1 主要使用仪器
主要使用仪器
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第4章 全文总结与展望
本论文从按蚊中肠共生菌构成多样性的角度探究了云南省盈江县、勐腊县和金平县三个接壤不同东南亚国家的边境县的野外雌性成年按蚊的中肠共生菌的构成多样性，得到了以下结论：
一、在野外捕蚊工作中，发现野外蚊虫的分布受到栖息地自然环境的改变和人类活动的影响，居民点人房和牲圈中按蚊的分布发生了变化。中华按蚊是优势蚊种，是三个地区的常见蚊种。
二、鉴定了云南省边境地区13种野外雌性成年按蚊的中肠可培养共生菌多样性。在门水平上，可培养共生菌的分类和常见的水体细菌组成十分相似，由变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门这4个门的细菌种类组成。不动杆菌属、假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属是边境地区9种野外按蚊中肠可培养共生菌共同的优势菌属，其中不动杆菌属、假单胞菌属是最优势的细菌种类，占鉴定细菌总数的34.2%（80/234）。
三、鉴定了云南省边境地区8种本地按蚊野外种群的中肠共生菌。发现按蚊对中肠共生菌的宿主选择作用起着重要影响，相同地区内、不同种类按蚊间，中肠共生菌的组成相似。勐腊县地区的中华按蚊中肠共生菌多样性低，弓形杆菌属占了相对丰度总量的85.08%。大肠-志贺杆菌属、假单胞菌属和乳酸杆菌属等细菌是本研究中所有按蚊中肠共生菌群的主要组成部分。不同地理种群和不同种类之间的组成差异与共有的 核心微生物群 共存，强调了中肠共生菌群的特异性和对宿主的适应性。
参考文献（略）
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