摘 要： 目的 探讨烟草中主要毒性成分尼古丁(NIC)是否加重他克莫司(TAC)诱导的肾脏损伤。方法 将32只雄性SD大鼠分为正常对照组(VH)组、TAC组、NIC组、NIC+TAC组，每组8只。各组分别给予橄榄油、TAC、NIC、NIC+TAC干预4 w。检测各组生化、肾功能、尿蛋白排泄量、肾小管间质纤维化(TIF)程度，免疫组化和Western印迹法分别检测致纤因子、细胞凋亡相关基因的表达。结果 与TAC组比较，NIC+TAC组血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿蛋白排泄量显着升高，肾小管间质纤维化(TIF)程度、肾小球系膜区面积显着扩大，转化生长因子(TGF)-β1表达显着增加；血清及尿排泄8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)显着增加，超氧化物歧化酶(SOD)1、SOD2表达显着降低，NADPH氧化酶(NOX)-2、NOX-4表达显着增加；B淋巴细胞瘤(Bcl)-2/Bcl-2相关X蛋白(Bax)比值显着降低，活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3显着增加，原位缺口末端标记(TUNEL)法显示TUNEL阳性细胞数显着增加(均P<0.05)。结论 NIC加重了TAC诱导的肾损伤，其机制可能与NIC加重氧化应激和细胞凋亡有关，暗示戒烟可能对服用TAC的移植吸烟者有益。
关键词 : 尼古丁;他克莫司;氧化应激;细胞凋亡;
Abstract： Objective To investigate whether nicotine(NIC), a major toxic component of cigarette smoking, exacerbates tacrolimus(TAC)-induced renal injury. Methods Sprague-Dawley rats were treated daily with NIC, TAC, or both drugs for 4 weeks. The influence of NIC on TAC-caused renal injury was examined via renal function, histopathology, expression of fibrotic mediators, oxidative stress, and apoptosis related gene.Results Both NIC and TAC significantly impaired renal function and histopathology, while combined NIC and TAC treatment aggravated these parameters beyond the effects of either alone. Oxidative stress was increased, the expression of fibrotic mediators and apoptosis related gene from either NIC or TAC were also exacerbated by the two combined.Conclusions NIC could exacerbate chronic TAC nephrotoxicity, which suggests that smoking cessation might be beneficial to transplant smokers taking TAC.
Keyword： Nicotine; Tacrolimus; Oxidative stress; Cell apoptosis;
他克莫司(TAC)作为一种非常有效的免疫抑制剂，已被广泛应用于器官移植、自身免疫性疾病、结缔组织病、难治性肾病综合征的治疗，尽管发现了不少新的免疫抑制剂，TAC仍是实体器官移植免疫抑制方案的基石。然而，长期使用TAC会增加不良反应的风险(如肾毒性、神经毒性、感染、恶性肿瘤、糖尿病和胃肠道不适)。众所周知，吸烟是导致各种癌症、心血管事件(心肌梗死和脑卒中)和阻塞性肺病的危险因素。吸烟是一项重大的公共卫生挑战，给社会带来经济负担，降低生活质量。在肾脏方面，吸烟会加重糖尿病、高血压、多囊肾和肾移植术后患者的肾功能不全程度[1]。吸烟还可能导致肾损伤，即使是不存在慢性肾脏病(CKD)的健康人群[2]。尼古丁(NIC) 作为烟草中的天然成分，有成瘾性及毒性作用，是对人体产生有害影响的罪魁祸首之一。吸烟是肾脏疾病的一个重要且可控制的危险因素，本研究通过NIC处理TAC诱导的肾损伤大鼠模型，探讨NIC加速其肾毒性的可能机制。
1、 材料与方法
1.1、 实验动物及分组
将32只体重为200～220 g的清洁级雄性SD大鼠(延边大学动物实验中心购买) ,分别置于恒定温度、湿度、光照控制的环境中，并允许自由摄入低盐饮食(0.05%盐饲料，低盐饮食增强TAC肾毒性) 和自来水。适应环境、低盐饮食和自由饮水后，体重匹配的大鼠随机分为4组，每组8只。①正常对照组(VH组):皮下注射橄榄油1 ml/(kg d)。②NIC组：皮下注射橄榄油1 ml/(kg d)+腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg d)。③TAC组：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg d)。④TAC+NIC组：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg d)+ 腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg d)。各组均每日9∶00给药，共处理4 w后处死大鼠，收集血液、尿液、肾组织标本以备进一步检测。本实验通过延边大学附属医院伦理委员会批准(YBU-2017-045)。
1.2 、生化检测
全自动生化分析仪测定血白细胞计数(ADVIA 120 ,日本拜耳公司);标准酶比色法测定血肌酐(Scr) 及血尿素氮(BUN)(Stanbio Lahoratory, Boeme, TX, USA);May-Grun-wald Giemsa 染色法计数淋巴细胞数，使用高效液相-串联质谱法测定TAC血药浓度(TAC con);尿蛋白排泄量测定采用酶学比色法(Modular DPP system, Roche)。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清和尿排泄中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG);采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Calbiotech, San Diego, CA) 测定大鼠血清和尿中的可替宁。
1.3 、肾脏病理
肾脏组织由过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液(PLP) 固定，过碘酸雪夫(PAS)染色，石蜡包埋后4 μm切片，Masson 三色染色，采用彩色图像自动分析仪(Olympus, 日本)高倍镜视野下分析肾小管间质纤维化(TIF)程度， 每个标本至少观察 20 个非重叠肾小管间质取平均值。
1.4、 Western印迹法
肾组织标本置于管中，加入蛋白质缓冲液(10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH7.6;150 mmol/ml氯化钠，1%脱氧胆酸钠，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%十二烷基硫酸钠，1%抑酶肽，2 mmol/L四氧嘧啶，1 ng/ml亮抑酶肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物),室温匀浆。然后在4℃下，13 000 r/min离心，取上清液，用Bio-Rad蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。取同等量的匀浆在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在90 V电压下转到硝酸纤维素膜2 h。浸入5%脱脂奶粉中封闭2 h, 在4℃下分别滴加一抗NADPH氧化酶(NOX)-2(1∶500)、NOX-4(1∶500)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2(1∶500)、转化生长因子(TGF)-β1(1∶500)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)(1∶500)、超氧化物歧化酶(SOD)1(1∶500)、 SOD2(1∶500)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3(1∶500)],一抗与5%脱脂奶粉混合，缓慢摇摆，4℃下过夜。TBST反复洗膜3次，加二抗4 h; TBST反复冲洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，摇床冲洗10 min。使用电化学增强(ECL)试剂增强发光，在暗室下胶片曝光，后采集图像。使用图像分析仪(Quantity One) 进行Western印迹图像分析。
1.5、 原位缺口末端标记(TUNEL)
根据 ApopTag in Situ Apoptosis Detection(Millipore)试剂盒操作步骤测定细胞凋亡，200高倍下数字化显微镜分析仪计数TUNEL 阳性细胞。
1.6 、统计学方法
采用SPSS19.0 软件进行单因素方差分析(Oneway ANOVA)和 Bonferroni post hoc 校正分析。
2 、结 果
2.1、 NIC对基本数据及肾功能的影响
与VH组比较，TAC组尿量明显增加，而NIC+TAC组尿量较TAC组进一步增加(P<0.05);TAC组、NIC组尿蛋白、BUN、Scr水平均明显升高(P<0.05),而NIC+TAC组的尿蛋白、BUN、Scr水平较TAC组进一步升高(P<0.05),提示NIC加重TAC诱导的肾功能不全。给药4 w后，血中TAC浓度增加，而NIC则不影响血TAC浓度，见表1。
表1 各组基本参数及实验室检测结果(x??±s,n=8)
2.2、 NIC对TAC诱导的肾纤维化及肾小球硬化的影响
TAC组与NIC组肾组织TIF程度明显增加，NIC+TAC组肾组织TIF程度较TAC组明显增加，见图1。Western印迹法结果显示，与VH组[(107.50±15.26)%]相比，TAC组[(192.90±17.14)%]与NIC组[(189.50±12.58)%]肾组织中TGF-β1表达量明显增加，NIC+TAC组[(253.20±22.56)%]肾组织中TGF-β1表达量较TAC组明显增加(P<0.05),提示NIC增强了TAC诱导的促纤维化TGF-β1过表达。见图2。
图1 各组肾组织TIF程度比较(Masson, ×200)
图2 Western印迹法检测各组肾组织TGF-β1的表达
与VH组[(1.34±0.58)%]相比，TAC组与NIC组肾组织PAS染色系膜面积[(16.23±1.99、14.48±1.56)%]明显增加， 而NIC+TAC组的肾组织中PAS染色系膜面积[(22.24±2.17)%]较TAC组明显增加(均P<0.05)。见图3。
图3 各组肾组织病理形态学变化(PAS,×1 000)
2.3、 NIC对TAC诱导的氧化应激的影响
与VH组比较，TAC组与NIC组血清及尿排泄8-OhdG含量均明显增多(均P<0.05),NIC+TAC组血清及尿排泄8-OHdG含量较TAC组明显增多(P<0.05),见表2。
表2 各组血及尿中8-OHdG水平的比较(x??±s,n=8,ng/ml)
与VH组相比，TAC组与NIC组肾组织中SOD1、SOD2表达降低，NIC+TAC组肾组织中SOD1、SOD2的表达较TAC组明显降低。见表3、图4。TAC组与NIC组肾组织中NOX-2、NOX-4的表达升高，NIC+TAC组肾组织中NOX-2、NOX-4的表达较TAC组明显升高。见表3、图5。上述分析显示，NIC上调了TAC诱导的NOX2和NOX4的表达，而抑制了SOD1和SOD2的表达，说明在本模型中NIC和TAC对氧化应激有协同作用。
表3 各组肾组织SOD1、SOD2、NOX-2、NOX-4、Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3的Western印迹表达量(x??±s,n=8,%)
图4 各组肾组织中SOD1、SOD2表达
图5 各组肾组织NOX-2、NOX-4表达
2.4、 NIC对TAC诱导的细胞凋亡的影响
大多数TUNEL阳性细胞或凋亡小体定位于肾小管上皮细胞和间质血管内皮细胞，尤其是萎缩的肾小管和典型的TIF区域。与VH组(0.8±0.1)mm2比较，TAC组与NIC组肾组织中TUNEL阳性细胞数量[(9.6±0.8)、(3.8±0.2)]mm2明显增加，NIC + TAC组肾组织中TUNEL阳性细胞数量(13.9±0.4)mm2较TAC组明显增加。见图6。Western印迹结果示，与VH组比较，NIC组与TAC组肾组织中Bcl-2/Bax比值降低，NIC+TAC组肾组织中Bcl-2/Bax比值较TAC组明显降低。TAC组与NIC组肾组织中活化的Caspase-3升高，NIC + TAC组肾组织中活化的Caspase-3较TAC组明显升高。见表3、图7。
图6 各组肾小管TUNEL阳性细胞数(×200)
图7 各组肾组织中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的表达
3 、讨 论
无论是健康人群，还是有基础疾病(如高血压、糖尿病)的患者，吸烟是一个可控制的引起CKD进展的危险因素[3]。研究表明，NIC会增加肾脏的氧化应激，从而损害肾小管和内皮细胞的活力和功能，改变肾脏血流动力学，损害整体肾脏功能[4]。此外，NIC增强系膜增生、影响细胞增殖与凋亡、促进细胞外基质堆积和促进肾纤维化途径来损害肾脏功能[2,5,6]。临床试验表明，吸烟可增加尿白蛋白排泄量，对肾功能产生不利影响，而戒烟可能改善蛋白尿和肾小球滤过率，同时也可能改善CKD和2型糖尿病患者的蛋白尿，并减缓终末期肾衰竭(ESRD)的进展[7,8,9]。此外，无论是移植物受体还是供体，吸烟都会导致移植排斥反应和慢性移植物肾病(CAN),最终导致肾移植中的移植物丢失[10,11]。提示吸烟可能会加速接受基于TAC的免疫抑制剂的移植肾功能的丧失。
作为有效且具有良好耐受性的临床免疫抑制剂，TAC的长期使用可导致肾小球系膜细胞和基质增多、小动脉透明质酸沉积、肾小管萎缩、肾小球硬化和肾脏间质纤维化，最终产生不可逆的肾脏损伤。本文说明NIC导致肾脏损伤，与先前研究一致[12]。然而肾毒性模型大鼠用NIC处理后肾功能损伤指标进一步升高，表明NIC加重TAC诱导的肾损伤。
慢性TAC肾毒性的主要改变在于肾小管间质区，如肾小管基底膜增厚、肾小管萎缩和肾小管纤维化。本研究发现，NIC加重了TAC诱导的部分系膜面积增加和TIF程度。这些病理改变引起更明显的肾功能损害和尿蛋白排泄的增加。提示吸烟可能加快接受免疫抑制剂治疗患者的肾功能损伤。戒烟可能成为延缓或治疗肾脏纤维化的重要手段。
慢性TAC肾损伤是多种因素共同导致的结果，TAC肾损伤与氧化应激之间存在密切关系。氧化应激是因为氧化还原系统遭到破坏，从而产生大量的活性氧。最近大量研究表明，慢性NIC暴露与肾脏损伤的氧化应激之间存在密切关系[13,14]。氧化应激在TIF及肾小球系膜硬化、足细胞异常和顶叶上皮细胞损伤的肾小球硬化中起着至关重要的作用[15]。8-OHdG作为体内DNA氧化损伤分泌最终产物的标志物，一般蓄积在肾间质和肾小管中，且与机体氧化损伤程度呈正相关。SOD是体内重要的抗氧化剂，在维持机体氧化与抗氧化的平衡中起着至关重要的作用。它能阻断自由基导致的脂质过氧化生成，保护其不受自由基的损害[16]。近年来多种不同的肾脏病理模型中发现NADPH氧化酶家族(NOXs) 促进肾脏氧化应激的发生。NOX-2和NOX-4是吞噬细胞中NADPH氧化酶的催化亚基。NOX-2的激活称为氧化爆发，促进活性氧的生成，导致肾脏损伤。郑茜子等[17]研究发现，抑制NADPH氧化酶系统可减轻大鼠肾间质纤维化。本研究说明NIC增加了氧化蛋白的表达，同时抑制了抗氧化蛋白的表达，从而加重了TAC诱导的氧化应激和肾脏纤维化。
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种独特形式。该过程在发育和维持内环境的稳定中起着至关重要的作用。TAC诱导的肾损伤与近端肾小管细胞凋亡有关。NIC通过氧化应激或激活TGF-β1诱导足细胞和肾近端小管细胞凋亡[18,19]。Bcl-2是抑制凋亡基因。Bax是Bcl-2蛋白家族的一员，当Bax与线粒体外膜结合时会启动细胞凋亡途径，从而改变其通透性并释放凋亡蛋白。凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2蛋白之间的平衡失衡，在启动凋亡途径的过程中发挥至关重要的作用[20]。Caspase-3是凋亡细胞死亡的执行者，其激活被认为是细胞死亡的一种承诺[21]。细胞和组织中Caspase-3活性检测是多种凋亡信号诱导的细胞凋亡的重要方法。上述研究表明，TAC和NIC均诱导细胞凋亡，而NIC能够加重TAC诱导的细胞凋亡，从而进一步导致肾脏损伤。
综上，NIC在TAC慢性肾毒性大鼠模型中加重了TAC诱导的肾损伤。氧化应激的加重和程序性细胞死亡可能是NIC有害作用的一个潜在机制。
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