摘 要： 白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)在引发血源性感染的病原微生物中位列第四，全国每年由C. albicans引起的各类感染性疾病高达千万例。该菌极易附着于植入医疗器械的表面，形成坚固生物被膜阻碍药物和免疫系统的进攻，给治疗带来了极大难度。同时，近年来C. albicans的高流行率和不断增强的耐药性使C. albicans的治疗面临更大的挑战。纳米材料因其具有低毒性、尺寸效应、良好的抑菌性，以及促进光动力抗菌作用等功效被广泛应用于抗感染治疗。本文综述了近年来纳米技术在C. albicans预防、诊断和治疗中应用的研究进展，并探讨其作用机制，为纳米技术抗C. albicans感染的进一步研究提供参考。
关键词： 纳米技术; 白色念珠菌; 抗感染; 应用;
Abstract： Candida albicans(C. albicans) is the fourth most common pathogenic microorganism that causes blood-borne infections, and 10 millions of various infectious diseases are caused by C. albicans in China every year. However, C. albicans can easily attach to the surface of implantable medical device and form a strong biofilm that resists the effects of drugs and the immune system, so it is extremely difficult to be killed. At the same time, the treatment of C. albicans also face a huge challenge due to its high prevalence rate and increasing resistance. Nanomaterials are widely used in the antibacterial field because of their lower toxicity, size effect, good antibacterial properties and enhancement to photodynamic antimicrobial chemotherapy. In this paper, we summarized the advance and possible mechanism of nanotechnology in the prevention, diagnosis and treatment of C. albicans, providing a reference for the further research of nanotechnology against C. albicans.
Keyword： nanotechnology; Candida albicans; antibacterial effects; application;
白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans)又叫白假丝酵母菌，是一种黏附寄生于人体口腔、阴道、胃肠道等黏膜及皮肤的常见真菌[1]，同时又是一种条件致病菌，某些因素(如p H改变、机体免疫功能下降、广谱抗生素和激素使用过度)会使正常菌落所处环境平衡被打破，C.albicans可迅速增殖，并转化为有强致病能力的菌丝体形态，侵入黏膜和组织深层或进入血液循环系统，引发浅表性、深部或系统性的C.albicans感染[2]。在全球范围内，念珠菌引发的感染病症每年约4 000万例，其中C.albicans是最常见也最致命的，约占念珠菌感染病例的50%～70%，总死亡率为43%[3,4]。随着广谱抗生素的滥用，以及癌症、糖尿病、艾滋病等使人免疫能力低下病症的盛行，C.albicans感染发病率逐年增加，并且深部C.albicans感染成为免疫抑制宿主死亡的主要原因之一[3]。此外，C.albicans常黏附于植入体内的医疗器械如导管、支架、起搏器、人工心脏瓣膜和膝盖、义齿等的表面，由生物医学设备周围的体液给菌体提供营养，并形成生物被膜[5]。然而，生物被膜不仅能降低C.albicans对药物的敏感性，使其对抗真菌药的抵御能力提高10～1 000倍，还可增强菌体在宿主免疫系统攻击下的存活能力[6]。目前药物治疗仍然是抗C.albicans感染的主要手段，但是传统抗真菌药物种类很少，常用药物仅有唑类、多烯类及棘白菌素类等，且其肝肾毒副作用强、价格昂贵，大多对生物被膜的作用有限，其广泛应用和无选择性的使用更是导致众多耐药菌株的产生[7]。因此，迫切需要研究出新的抵抗C.albicans的治疗策略。
纳米颗粒因其尺寸微小和比表面积较大，更易透过生物膜与真菌相互作用，近年来被广泛应用于抗真菌研究[8,9,10]。与传统抗菌剂相比，以纳米银(silver nanoparticles,Ag NPs)为代表的一些金属纳米粒子不仅具有良好的抗菌活性，而且其抗菌谱更广、抗菌更持久、化学性能更稳定，不易产生耐药性[11]。因而大量科研人员将纳米技术引入C.albicans的诊治中，期望借助纳米技术降低C.albicans的感染机率，改善其耐药性，增加药物的疗效和安全性，为设计新型抗真菌药物提供方向。
1、 纳米技术在预防C.albicans感染中的应用
不治已病治未病 是中国最早的医学典籍《黄帝内经》中提出的观点，也是中医药的精髓理论。西医则称之为第一级预防亦称病因预防，即在疾病发生之前，针对健康影响因素采取措施，防止或减少疾病发生。疫苗是预防C.albicans感染的重要策略之一，近年来有众多学者对其进行了研究。
1.1、 在研制疫苗方面的应用
常见的真菌疫苗有全菌疫苗、蛋白疫苗、糖结合疫苗及核酸疫苗等，但大多数仍停留在实验室阶段，目前还没有被允许投入临床使用的真菌疫苗[12]，所以对C.albicans疫苗的研制仍是现阶段的重要任务。Carneiro等[13]采用单油酸甘油酯作为稳定剂制备了双十八烷基二甲基溴化铵脂质体，作为C.albicans细胞壁蛋白的载体，该脂质体制剂性质稳定，无细胞毒性，可被巨噬细胞摄取。该研究进一步发现，制备的纳米脂质体显示出良好的佐剂活性，可诱导免疫小鼠表现出强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答。与仅使用细胞壁蛋白单独免疫的小鼠相比，该系统可诱导高水平的白介素-17和干扰素-γ，说明该纳米脂质体对辅助型T细胞介导的免疫应答有极化作用，从而确认其具有免疫佐剂的潜力。关丽影[14]将壳聚糖(chitosan,CS)与C.albicans热休克蛋白90重组质粒制备成CS-核酸疫苗纳米粒，经皮下两点注射的方式免疫小鼠，发现制成的CS纳米粒子不仅能够帮助重组质粒抵御酶解，还可使免疫小鼠产生抗重组蛋白的特异性抗体，同时对核酸疫苗还起到了明显的缓释作用。尽管这方面研究不是很多，但免疫效果比较明显，因此，为预防C.albicans或其它真菌感染提供了新的思路。
1.2、 在预防植入性生物材料被C.albicans污染中应用
C.albicans是人口腔中的常见共生真菌，非常容易黏附于植入材料如义齿或导管表面，并在其上形成生物膜，这是C.albicans感染的常见途径之一。然而，一旦形成生物膜，C.albicans对抗机体免疫力及抗真菌药物的能力就会大大增强，从而导致机体反复感染。临床上常用手术刮除或药物治疗等手段除去植入性医学生物材料表面的生物膜，但这些方法受花费高、毒性强、疗程长和耐药性等限制[2]。因此，对常用的植入材料进行改良来抑制病原菌黏附和菌膜形成是预防C.albicans感染的有效策略之一。常见的改良方式有两种。(1)材料中掺杂不同物质。如Li等[15]探索了在丙烯酸树脂基托材料中加入Ag NPs之后对C.albicans的抵御作用，结果表明加入Ag NPs后不仅可以通过Ag NPs本身的抗真菌作用抑制生物被膜的产生，银离子浓度达到5%时还能抑制C.albicans的黏附。Lee等[16]发现，氧化石墨烯纳米片的添加可提高义齿材料聚甲基丙烯酸甲酯对C.albicans的抗黏附效果。其作用机制主要基于氧化石墨烯提供的大量羟基和羧基基团能够增加聚甲基丙烯酸甲酯的亲水性，有助于在其表面形成致密的水合层，对于防止微生物黏附起到物理屏障作用。(2)改良材料表面性质。如李斌等[17]考察了在义齿基托表面镀用纳米非晶金刚石薄膜的抗C.albicans黏附作用效果，发现金刚石膜能够通过提高义齿表面光洁度来减少C.albicans在其表面的黏附，其耐腐蚀和膜基结合力强等特性还能保证长期抑菌，为开发减少真菌黏附的义齿材料提供了新的思路。此外，Beltrán-Partida等[18]发现，用超氧水消毒钛合金-Ti O2纳米管制备的牙科材料抗C.albicans黏附作用可持续24 h，同时可抑制生物膜形成和定植。作用机制主要是破坏真菌-材料界面处的黏附点，进而减少真菌定植。
2、 纳米技术在抗C.albicans诊断中的应用
早发现、早诊断、早治疗 被列为第二级预防亦称临床前期预防，可逆转、停止或延缓病变的发展，是提高患者生存率和生活质量的关键因素。第二级预防对于C.albicans感染的治疗尤为重要，一旦C.albicans侵入血液，并进入器官当中，再进行治疗就非常困难，死亡率极高。因此，早确诊、早治疗是C.albicans抗感染的最佳选择。
目前，检测C.albicans感染的常用方法主要有血培养法、分子生物学法、直接镜检法等。其中，血培养法被认为是临床上真菌感染诊断的金标准，但是敏感性差且培养时间较长，容易错过最佳治疗时间。其他方法也存在价格昂贵、重现性较低等缺点，难以满足临床诊治需求[2]。因此，对早期诊断新方法的开发刻不容缓。Tian等[9]将刀豆蛋白A与超顺磁性纳米颗粒作用得到表面荷电的磁性纳米粒子，利用带正电的纳米粒与C.albicans细胞壁的甘露聚糖产生特异性结合及强静电作用来捕获C.albicans。研究发现，在102～107 cfu/m L的初始酵母浓度范围内，磁性纳米颗粒均表现出良好的酵母分离效率[9]。然后，采用荧光素-刀豆蛋白A荧光染色和T2磁共振分析对捕获的C.albicans进行检测。Misiak等[19]制备了Yb3+和Tm3+共掺杂Ca F2纳米颗粒，并用蛋白质G对其表面修饰。采用蛋白质G功能化上转换纳米晶对C.albicans进行标记和成像，表现出良好的信噪比和较高的特异性。此外，东北师范大学王丽课题组首次利用噬菌体文库对氧化铁纳米颗粒进行筛选，他们分别将单一多肽及结合在抗分泌型天冬氨酰蛋白酶2(secreted aspartyl proteinase 2,Sap2)抗体上的多肽展示在不同噬菌体展示系统上，与氧化铁纳米颗粒孵育后，制备了一种双展示噬菌体磁性纳米纤维[2,20]。Sap2抗体是临床辅助诊断C.albicans感染的重要检测标志物，一般在感染的初期就会产生。将上述磁性纳米纤维用于Sap2抗体的检测研究发现，该检测方法的最低检测限为1.1 pg/m L，大大提高了常规抗原Sap2检测方法的灵敏度，约降低了2个数量级。上述研究说明，纳米技术的引入不仅可以使C.albicans的检测方法多样化，且更加灵敏和精准，值得进一步深入开发和利用。
3 、纳米技术在抗C.albicans治疗中的应用
3.1 、纳米颗粒在抗C.albicans治疗中的应用
随着抗真菌药物越来越多地应用于临床，真菌耐药性问题日益突出，其中C.albicans的耐药率也在逐年上升，甚至出现了多重耐药菌。如何减少真菌的耐药性、什么样结构的药物既能有效抗真菌又对机体没有更大毒性？这是医药科技工作者迫切需要解决的难题。为此，有研究人员开发出了噬菌体、细胞壁水解酶和抗菌肽等一些新型的抗生素替代品，同时也有科研团队关注纳米材料在疾病治疗中的作用。Priyadarshini等[21]将碳点(carbon dots,CDs)覆盖在金纳米颗粒(gold nanoparticle,GNP)表面形成一种纳米共轭结构，并比较了五种不同粒径的Au@CDs纳米粒子对C.albicans的抑制效果。结果表明，纳米粒对C.albicans的毒性主要源于CDs的高毒性，并且纳米粒子的粒径越小、比表面积越大，致使更多的CDs渗透到菌体中通过产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)杀伤真菌。Wani等[22]采用超声化学方法制备出粒径约2 5 n m的金纳米盘和粒径约为3 0 n m的多面体GNP，并比较了两种GNP对C.albicans的抑制效果。结果显示，两种纳米粒均有抑菌活性，但金纳米盘比多面体GNP具有更好的抑制作用。分析其机理，可能是GNP直接与质膜H+-三磷酸腺苷酶相互作用，使质子泵活性降低，导致C.albicans无法吸收养分供其正常生长。与多面体GNP相比，具有更小粒径的金纳米盘拥有更大的比表面积，与细胞膜上蛋白结合位点之间的作用更强，且更易透过质膜进入真菌内部发挥金的毒性作用，该研究为提高抗真菌药物疗效提供了全新的思路。
此外，据报道，CS、银、硒及氧化锌等纳米粒对C.albicans均有不同程度的抑制作用。其中，纳米硒由于其低表面能和带负电等特性使其极易黏附在菌体表面，渗入菌体内并通过收缩折叠细胞膜改变其形态，杀伤病菌[23]；氧化锌纳米粒和Ag NPs则均能使C.albicans体系中生成更多ROS，促进杀菌效果[24,25]。进一步研究发现，纳米CS对变形链球菌和C.albicans双菌种构成的生物膜总能量及两菌细胞活力均有明显的抑制作用，且存在浓度依赖性[26]。此外，Randhawa等[5]发现，粒径为5～20 nm的两性霉素B、酮康唑和百里香醌颗粒对C.albicans及其生物膜的抑制效果是微米级药物的2～4倍，分析原因可能是纳米级药物由于其尺寸微小更易进入细胞体内；并且，相同粒径条件下，上述药物对C.albicans的抗菌活性是其生物膜的8～10倍。
3.2、 纳米载体在抗C.albicans治疗中的应用
近年来，随着纳米技术的蓬勃发展，人们逐渐认识到纳米材料作为药物载体具有多种优势，如增加药物稳定性、改善其溶解行为、促进药物在体内转运、靶向分布等，进而增强药物疗效甚至实现多功能化治疗[27]。因此，有大量研究人员将载药纳米材料用于抗C.albicans感染的研究。
众所周知，巨噬细胞是人体固有免疫的重要组成部分，通过识别、吞噬和处理抗原等作用来降低感染发生的可能性，是抵御外来病原菌的第一道防线。山东大学药学院姜新义团队提出一个对抗C.albicans感染的新思路，即通过调控巨噬细胞分化的免疫策略来抵抗系统性C.albicans感染[28]。他们报道了一种可生物降解的纳米三元复合物 甘露糖修饰的CS负载伊马替尼，研究表明，该甘露糖化纳米复合物能够提高巨噬细胞表面M1型受体CD80的比例，增加肿瘤坏死因子-α、白介素-6以及诱导型一氧化氮合酶的表达，促进体外实验中巨噬细胞对C.albicans的吞噬能力。同时，在体实验证明，该纳米复合物可利用巨噬细胞再分化的调节途径来指导其原位重塑，使小鼠脾脏C.albicans载量显着降低，脾脏中M1型巨噬细胞比例明显提高，从而增强机体抗C.albicans感染的能力，该研究成果为治疗病原微生物感染提供了新的免疫调控研究思路。此外，有科研人员分别采用丝素蛋白、p H响应胶束体系及乳化给药系统[29,30,31]作为药物载体，考察了载体在药物抑制C.albicans方面是否有促进作用。结果非常令人兴奋，载体不仅能有效地递送伊曲康唑、改善药物释放，而且能够抑制菌丝的产生，干扰菌膜的形成[29]。此外，姜黄素-丝素蛋白纳米粒能够减少C.albicans黏附在细胞表面，抑制生物膜产生，与姜黄素相比具有更高的水溶性和抗菌活性[30]。
临床研究发现，C.albicans往往与一种甚至多种微生物在医疗器械表面形成双菌种或多菌种抗性更强的生物膜，为其治疗带来更大困难[6]。因此，探索新的抗多菌种生物膜的药物或治疗手段迫在眉睫。Monteiro课题组将氯己定负载在CS功能化氧化铁纳米粒(iron oxide nanoparticles,IONPs)上，得到IONPs-CS-氯己定纳米系统，并考察了该纳米系统对C.albicans和变形链球菌共感染形成的双物种生物膜的抑制作用[32]。结果表明，IONPs-CS-氯己定的存在可以使双物种菌落数减少4.27 log10。然而，作用于已形成的双物种生物膜时，效果略有下降，使菌落数减少了3.25 log10。此外，Monteiro课题组还将CS功能化的IONPs作为咪康唑的载体，考察其对C.albicans和光滑念珠菌双菌种生物膜的抑制效果[33]。研究结果证实，IONPs-CS-咪康唑与单独咪康唑相比，在降低生物膜代谢活性和细胞活力方面表现出更强的作用效果，可降低生物膜代谢活性93.04%～94.40%,C.albicans菌落数减少1.85～2.05log10，但对生物膜的总生物量和细胞外基质成分无显着影响。
3.3 、纳米技术辅助光动力抗菌化学疗法在抑制C.albicans感染中的应用
光动力抗菌化学疗法(photodynamic antimicrobial chemotherapy,PACT)是近年来新兴的一种抗菌方法，该方法主要是借助特定波长的光照射聚集在病灶区的光敏剂时，可激活光敏剂产生单线态氧等ROS，同时可诱发一系列声化学反应及物理作用，达到杀伤微生物的目的[26,34]。该技术不易诱发耐药菌的产生，因此近年来有科研人员将其用于抗C.albicans的感染中，并取得了较好的作用效果。
Yang等[35]将二氢卟吩e6封装在溴化十六烷三甲基铵(cetyltrimethyl ammo-nium bromide,CTAB)制备的脂质体中，考察其介导的PACT在抑制C.albicans上的效果。实验结果证实，脂质与二氢卟吩e6的摩尔比越低、脂质体粒径越小及脂质体中CTAB的浓度越高，负载二氢卟吩e6的CTAB-脂质体对C.albicans的敏感株和耐药株可展示出更强的光动力抗菌效果。Khan等[36]考察了GNP对于亚甲蓝(methylene blue,MB)介导的PACT在对抗顽固性C.albicans生物膜过程中的增强作用，实验结果证实，GNP可以明显促进MB介导的PACT作用，使C.albicans生物膜抑制率从单独使用MB时的81.9%提高到95.4%。Sherwani等[37]则考察了在C.albicans感染的雌性巴比赛小鼠体内，GNP对于MB和甲苯胺蓝(toluidine blue,TB)介导PACT的促进作用。研究结果表明，不论是无光照GNP-MB和GNP-TB组，还是GNP-MB和GNP-TB介导的PACT组均可以减少生物膜的形成，并且发现GNP与MB和TB之间具有明显的协同作用。进一步的实验数据显示，PACT实验组可将生物膜抑制率从单独使用G N P-M B或G N P-T B组的4 0%～5 0%提高到接近80%，充分说明GNP能够明显提高PACT在抗生物膜方面的作用。
4 、纳米技术抗C.albicans作用机制研究
纳米材料抗C.albicans的机制比较复杂，主要可概括为以下几方面：(1)纳米粒子具有较大的比表面积，可增强其与C.albicans的相互作用，而极小的尺寸促使其更易渗透到细胞内发挥作用[5,8];(2)通过改变细胞膜的流动性和完整性，或者使胞内微环境改变，从而影响其物质转运等正常功能[10];(3)借助某些因素(如光照)产生羟基自由基、超氧负离子等ROS，利用ROS引起系列氧化应激反应，使微生物内有机组成成分的化学键断裂，对DNA等生物分子造成严重的氧化损伤。此外，还有研究表明ROS可通过激活钙离子流从而破坏钙离子通道的正常功能，影响正常信号传导，从而达到杀菌效果[10,31];(4)影响生物膜相关基因的表达，GNP对C.albicans细胞膜上两种重要基因均有明显抑制作用；(5)金属离子溶出机制[32,38]，金、银、锌等重金属离子可与带负电的细胞膜静电吸附，进而扩散入菌体内与酶蛋白或核酸上的硫或磷相互作用，使酶失活或DNA结构改变；(6)纳米粒子直接与质膜上一些重要的蛋白质相互作用使蛋白质变性，导致质子泵的正常功能受到干扰从而发挥杀菌作用[22,39];(7)利用纳米材料特性增强抗菌性或者改变材料表面性质，进而抑制C.albicans在植入性医学生物材料表面的吸附或定植。
5 、展望
近年来，C.albicans感染逐年增加的发病率和不断增强的耐药性使其预防与治疗几乎成为全球性的难题，引起了国内外学者的广泛关注，针对C.albicans感染的相关研究和文献也不断涌现。将纳米技术引入抗C.albicans感染不仅能减缓真菌耐药性，还能增强抑菌效果与靶向性。有些纳米材料不仅对病原菌构成的生物膜有很好的抑菌作用，还能有效抑制生物被膜的形成。此外，针对近年来出现的多菌种生物膜抗感染研究也取得了一定进展。但目前纳米技术应用于抗C.albicans感染的研究仍处于初级阶段，针对生物效应的机制方面研究较少，纳米材料的抑菌机制和作用靶点仍不十分明确，纳米制剂靶向治疗方面的研究更是薄弱，因此，系统地对纳米材料或纳米载体促进抗C.albicans的效果机制进行探讨将成为一个具有突破性的研究方向，而真菌基因组学技术可能是帮助人们深入理解作用机制的另一个重要突破点。此外，纳米技术想要在抗C.albicans感染临床应用中推广开来，仍然面临着体内不可控、未知的毒性和不良反应等难题，需要大量的动物实验和临床研究做补充。因此，在今后的研究中，需要更深入地关注纳米材料应用于抗C.albicans感染的抑菌机制、耐药机制、体内代谢和药物毒性等，从而为纳米制剂更高效、安全地应用于真菌感染临床治疗中奠定基础。
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